ClC-7 ist ein Chloridkanalprotein von bisher unbekannter Funktion. Zwei alternative Gentargeting-Strategien für die Ausschaltung von ClC-7 wurden angewandt, die zu den Linien C7A und C7B führten. In Knockout-Tieren von Linie C7A war kein ClC-7-Protein mehr nachweisbar. Durch Targeting-Vektor C7B hingegen wurde das LacZ-Gen von E.Coli als Reportergen im Leserahmen in Exon 7 des Gens Clcn7 eingefügt. Auf diese Weise wurde unter Kontrolle des Promoters von Clcn7 ein Fusionsprotein gebildet, das aus einem N-terminalen Fragment von ClC-7 und der vom LacZ-Gen kodierten b-Galaktosidase bestand. Die enzymatische Aktivität der b-Galaktosidase konnte für die Untersuchung der Gewebeverteilung von ClC-7 im Embryo eingesetzt werden. Es ergab sich ein breites Verteilungsmuster mit besonders hoher Expression in Osteoklasten, Dorsalganglien, Trigeminalganglion, Rückenmark, Gehirn und Auge. Diese Befunde wurden durch eine in situ Hybridisierung an Embryonenschnitten bestätigt. Der Phänotyp der Clcn7-/--Tiere beider Linien unterschied sich nicht. Die Heterozygotie führte zu keinerlei pathologischen Veränderungen gegenüber dem Wildtyp. Der Anteil von Knockout-Tieren aus Verpaarungen zweier heterozygoter Tiere war auf 15% reduziert, was für eine erhöhten postnatale Sterblichkeit sprach. Die überlebenden Knockout-Mäuse blieben ab dem Ende der ersten Lebenswoche im Wachstum zurück, und zeigten verkürzte, röntgenologisch abnorm dichte Röhrenknochen. Der Zahndurchbruch blieb aus. In der Histologie des Knochengewebes zeigten sich Charakteristika einer Marmorknochenkrankheit (Osteopetrose). Eine trotz vorhandener Osteoklasten entstehende Akkumulation von Knochenmaterial wies darauf hin, dass diese Zellen Knochen nicht resorbieren konnten. Aufgrund des Verschlusses der Markhöhle der Knochen entstand eine extramedulläre Blutbildung, die eine bei Clcn7-/--Mäusen auftretende Anämie und Milzvergrößerung erlärte. Die Lebenserwartung der Knockout-Tiere lag bei maximal 45 Tagen. Gleichzeitig trat eine massive Neurodegeneration auf, die in der Retina zu einem Verlust der Photorezeptoren und im Gehirn zu einer fortschreitenden Astrogliose führte. Beide degenerativen Prozesse scheinen nicht sekundäre Folge der Osteopetrose zu sein. Im Gegensatz zu den von der Degeneration betroffenen retinalen Zellen konnte in Neuronen des Gehirns die intrazelluläre Ablagerung eines Lipofuszin- artigen Speichermaterials nachgewiesen werden. Die Analyse der subzellulären Lokalisation in den weitgehend normal differenzierten Osteoklasten ergab, dass sich ClC-7 in der Ruffled Border Membran dieser Zellen befand. Diese stark gefaltete Membran ist für die Säuresekretion verantwortlich, die für die resorptive Aktivität der Osteoklasten Voraussetzung ist. Die Analyse kultivierter Osteoklasten zeigte, dass Clcn7-/-\- Zellen nicht in der Lage waren, die extrazelluläre Resorptionslakune anzusäuern. Im proximalen Tubulus der Niere wurde darüber hinaus durch Kolokalisation mit intrazellulären Markern und endozytiertem, fluoreszenzmarkierten Protein eine subzelluläre Lokalisation von ClC-7 in späten Endosomen und Lysosomen festgestellt. Da der Phänotyp der Clcn7-/--Tiere dem Bild der menschlichen infantilen malignen Osteopetrose sehr ähnelte, wurde das Gen CLCN7 in 12 Fällen dieser Erkrankung auf Mutationen durchsucht. Ein Patient war compound-heterozygot für eine Missense-Mutation und eine Stopmutation. In Proteinlysaten von kultivierten Fibroblasten des Patienten war ClC-7 nicht detektierbar. Nach den bisherigen Erkenntnissen handelt es sich bei ClC-7 um ein in späten Endosomen, Lysosomen und in der Ruffled Border Membran befindliches Chloridkanalprotein. Wahrscheinlich ist ClC-7 für den Transport von Cl- entlang des durch die H+-ATPase erzeugten Protonengradienten verantwortlich, was die elektroneutrale Ansäuerung der betreffenden Kompartimente ermöglicht. Ohne intakte Ansäuerung verlieren einerseits die Osteoklasten ihre Resorptionsfähigkeit, andererseits kommt es vermutlich aufgrund eines defekten lysosomalen Abbaus zu intrazellulären Ablagerungen und zur Schädigung von neuronalen Zellen in Retina und Gehirn.
ClC-7 is a ubiquitously expressed chloride channel whose function was unknown so far. Mice deficient for ClC-7 were generated using two different gene targeting strategies. Whereas targeting construct C7A abolished expression of ClC-7 completely, the LacZ gene was fused in frame into exon 7 of Clcn7 as a reporter gene in construct C7B. Using the reporter gene to assess the expression pattern of ClC-7, we detected strong signals in osteoclasts, dorsal root ganglia, trigeminal ganglion, retina, spinal cord and brain beside a ubiquitous basal expression level. These findings were corroborated by in situ hybridization. Clcn7-/- mice of both knockout-strains show the same severe osteopetrosis (marble bone disease) that becomes apparent shortly after birth, leading to an increased early postnatal lethality. Life expectancy of the surviving animals was reduced to maximal 45 days. Those mice were anemic and much smaller than wildtype mice. Additionally, there was progressive neurodegeneration in the retina and the brain. It could be excluded that this degeneration was secondary to osteopetrotic changes in Clcn7-/- mice. An accumulation of a lipofuscine-like material was detected in cerebral neurons, whereas no such material could be seen in the retina. Although osteoclasts are present in normal numbers, they fail to resorb bone because they cannot acidify the extracellular resorption lacuna. In osteoclasts, ClC-7 is highly expressed in the ruffled membrane that is formed by the fusion of H+-ATPase containing vesicles and that secretes protons into the lacuna. In the proximal tubule of the kidney ClC-7 probably resides in late endosomes and lysosomes. The murine phenotype closely resembles human infantile malignant osteopetrosis. Therefore, in 12 patients suffering from this disease a screening for mutations in the human gene, CLCN7, was performed. One patient was compound heterozygous for a nonsense and a missense mutation. These mutations lead to a complete loss of the ClC-7 protein from cultured fibroblasts of the patient. It is concluded that ClC-7 provides the chloride conductance required for an efficient proton pumping by the H+-ATPase of the osteoclast ruffled membrane. The insufficient acidification in Clcn7-/- mice therefore prevents bone resorption. A similar acidification defect in lysosomal compartments may cause neuronal storage because of decreased degradation.
