CEACAM1-Isoformen In PC12-Zellen der Ratte wurden die Spleißvarianten CEACAM1-4L und CEACAM1-4S nachgewiesen. Zusätzlich wurden zwei neue Isoformen, CEACAM1-4C1 und CEACAM1-4C2, identifiziert. Beide Formen sind sekretierte Proteine. Das CEACAM1-4C2 weist einen zu CEACAM1-4L identischen C-Terminus auf. Mittels eines Antiserums gegen die zytoplasmatische Domäne von CEACAM1-4L konnte CEACAM1-4C2 deshalb auf Proteinebene sowohl in vitro in konditioniertem Medium von PC12-Zellen als auch in vivo in Rattenserum nachgewiesen werden. Im Serum von Hepatom-tragenden Tieren war CEACAM1-4C2 verstärkt nachzuweisen. Signaltransduktion des CEACAM1 Die CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung konnte nach Inhibition zellulärer Tyrosinphos-phatasen mit dem Phosphataseinhibitor Pervanadat dargestellt werden. Die Modulation der makromolekularen Organisation des CEACAM1 durch Gabe von Antikörpern wurde angewendet, um einen CEACAM1-spezifischen Reiz zu erzeugen. Die Stimulation mit dem anti-CEACAM1 mAk Be 9.2 in Kombination mit einem sekundären Antikörper bewirkte dabei die Erzeugung großer CEACAM1-Cluster in der Plasmamembran. Die Stimulation von CEACAM1 durch Clustern hatte seine schnelle und reversible Tyrosin- Dephosphorylierung zur Folge. Eine direkte Auswirkung dieser Dephosphorylierung bestand in der Modulation der Bindung der Tyrosinphosphatase SHP2 an CEACAM1: Diese Interaktion war von der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung abhängig und wurde deshalb nach Stimulation verringert. Das an der Membran initiierte Signal bewirkte im Zytoplasma die temporäre und spezifische Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1 und ERK2. Die verwandten MAP-Kinasen JNK und p38 wurden dagegen nicht aktiviert. Nach der durch NGF induzierten neuronalen Differenzierung der PC12-Zellen war das konstitutive Niveau der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung reduziert und die Stimulation von CEACAM1 führte nicht mehr zu einer weiteren Dephosphorylierung. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett Die Stimulation des CEACAM1 durch Clustern bewirkte seine Bindung an das Aktin- Zytoskelett. Es wurde ein Versuchssystem etabliert, bei dem die Extrahierbarkeit von CEACAM1 aus Zellen mit Detergens Triton X-100 als Maß für die Interaktion mit dem Aktin-Kortex diente. Die F-Aktin-destabilisierenden Reagenzien Cytochalasin D und Latrunculin A konnten die Cluster-induzierte Unlöslichkeit des CEACAM1 deutlich verringern. Die CEACAM1-Aktin-Interaktion war abhängig vom Zustand der Zellen: Sowohl die Erhöhung der Zelldichte als auch die neuronale Differenzierung der PC12-Zellen bewirkte eine verstärkte Interaktion. Die CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung hatte keinen Einfluß auf seine Bindung an Aktin, umgekehrt aber war ein intaktes Zytoskelett für die Regulation der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung von Bedeutung. Der zytoplasmatische Teil des CEACAM1 war nicht nötig für die Cluster-induzierte Bindung an das Aktin-Zytoskelett, wie durch Verwendung der Mutante CEACAM1-DC ohne zytoplasmatischen Teil gezeigt wurde. Die Kolokalisation von CEACAM1 und Aktin an Zellkontakten in Barbe-Endothelzelen war dagegen nur für CEACAM1-4L nachweisbar.
CEACAM1-Isoforms In rat PC12 cells, the CEACAM1-4L and CEACAM1-4S splice variants were detected. Additionally, two novel isoforms, CEACAM1-4C1 and CEACAM1-4C2 were identified. Both are secreted proteins. The C-terminus of CEACAM1-4C2 is identical to that of CEACAM1-4L, which allowed the specific detection of CEACAM1-4C2 on the protein level by an antiserum directed against the CEACAM1-4L cytoplasmic part. CEACAM1-4C2 was found both in vitro in conditioned cell culture medium from PC12 cells and in vivo in rat serum. In serum of animals with a growing Morris hepatoma, the CEACAM1-4C2 level was elevated. CEACAM1-mediated Signal Transduction CEACAM1 tyrosine phosphorylation was detectable after inhibition of cellular tyrosine phosphatases with the phosphatase inhibitor pervanadate. The modulation of CEACAM1 macromolecular organisation by addition of antibodies was applied in order to induce a CEACAM1-specific stimulus. Treatment with the anti-CEACAM1 mAb Be 9.2 in combination with a secondary antibody caused the formation of large CEACAM1-clusters in the plasma membrane. Stimulation of CEACAM1 by clustering induced its fast and reversible tyrosine dephosphorylation. The interaction of CEACAM1 with the tyrosine phosphatase SHP2 was directly influenced by this dephosphorylation: the interaction, which is dependent on CEACAM1 tyrosine phosphorylation, was reduced after stimulation. The signal initiated at the membrane caused the reversible and specific activation of the MAP kinases ERK1 und ERK2. In contrast, the activity of the related kinases JNK and p38 remained unchanged. Neuronal differentiation of PC12 cells with NGF reduced the constitutive level of CEACAM1 tyrosine phosphorylation and abolished further dephosphorylation upon stimulation of CEACAM1. Interaction of CEACAM1 with the Actin Cytoskeleton Stimulation by clustering caused CEACAM1 to bind to the actin cytoskeleton. An assay was established, in which the degree of insolubility of CEACAM1 after extraction of cells with the detergent Triton X-100 was calculated as a measure for its interaction with the actin cortex. The F-actin-destabilizing reagents cytochalasin D and latrunculin A significantly reduced the level of clustering-induced CEACAM1 detergent insolubility. The CEACAM1-actin-interaction was dependent on several aspects of the cellular state: both an increase in cell density as well as neuronal differentiation of PC12 cells induced a stronger interaction. The level of CEACAM1 tyrosine phosphorylation had no influence on its interaction with actin. Contrary, an intact cytoskeleton was important for the regulation of CEACAM1 tyrosine phosphorylation. The cytoplasmic part of CEACAM1 was dispensable for the clustering-induced binding to the actin cytoskeleton, demonstrated with a deletion mutant lacking the cytoplasmic tail. Adversly, the colocalization of CEACAM1 and actin at cell contacts in Barbe endothelial cells was only detected for CEACAM1-4L.
