Liposomen waren in den letzten Jahren Fokus intensiver Forschungen und haben sich insbesondere als Vektoren im Rahmen des Drug Targeting etabliert. Für kationische Liposomen konnte eine Anreicherung in den Endothelzellen des Tumorgefäßbettes nachgewiesen werden, so dass sie im Rahmen eines neovaskulären Targetings zur antiangiogenen Tumortherapie intensiven Forschungen unterzogen wurden und werden. Ziel dieser Arbeit war es, die Aufnahme kationischer Liposomen durch proliferierende mikrovaskuläre Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs in vitro zu untersuchen, um Gemeinsamkeit und Unterschiede in der Prozessierung kationischer Liposomen zwischen Endothelzellen aus gesunden Organen und aus Tumoren aufzudecken. Die Glykokalix als Vermittler vieler zellulärer Aufnahmemechanismen sollte für die eingesetzten Endothelzellkulturen charakterisiert werden, um Hinweise zu erhalten, ob sie Einfluss auf die Aufnahme kationischer Liposomen haben könnte. Darüber hinaus deutete sich in den durchgeführten Versuchen zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der Aufnahme an, dass die Liposomen ein zytotoxisches Potential besitzen. Aus diesem Grunde wurden Untersuchungen zur Induktion der Apoptose durch Inkubation kationischer Liposomen mit proliferierenden Endothelzellen durchgeführt, um dieses Phänomen näher zu charakterisieren. Zum Einsatz kamen Endothelzellen, die aus gesunden Organen isoliert worden waren (Endothelzellen aus dem bovinen Corpus luteum in Regression; BCl Rcobble), Endothelzellen aus der Haut eines Menschen; HMVEC) ebenso wie eine Endothelzellkultur, die spontan transformiert war (MHEC5, isoliert aus dem Herzmuskel einer Maus). Es wurden phasenkontrast-, fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Liposomeninkubation ebenso wie Apoptosetests nach Liposomeninkubation und spezielle Färbungen der Glykokalix für elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. In diesen Studien wurde erstmals die Glykokalix der hier eingesetzten Endothelzellkulturen in vitro charakterisiert. An allen Zellen ließ sich die Glykokalix mit einer durchschnittlichen Höhe von 10-30 nm deutlich darstellen, jedoch unterschieden sich die Endothelzellen hinsichtlich der Ausprägung der Glykokalix. Die humanen Endothelzellen wiesen eine gleichmäßig hohe Glykokalix auf. Im Vergleich dazu war die Glykokalix muriner und boviner Endothelzellen an einigen Stellen von Konglomeraten überragt und somit unregelmäßig hoch und aufgeraut, in der Grundhöhe jedoch vergleichbar der Glykokalix humaner Endothelzellen. Diese aufgeraute Glykokalix trat insbesondere auf der luminalen Seite der Zellen an Zellausläufern auf. Am auffälligsten war, dass bei den bovinen Endothelzellen die Glykokalix stellenweise unterbrochen war, während sie bei den murinen und humanen Endothelzellen die Zellen vollständig umgab. Zur Untersuchung der Aufnahmemechanismen der Liposomen durch die Endothelzellen wurden markierte Liposomen für fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Studien eingesetzt. In allen Studien wurden die Liposomen durch die eingesetzten Endothelzellen gebunden und internalisiert, jedoch waren Unterschiede zwischen den Kulturen auffällig. Quantitativ nahmen die murinen Endothelzellen, die spontan transformiert waren, am meisten kationische Liposomen auf, sie banden bis zu 10 Mal so viele Liposomen wie die humanen und die bovinen Endothelzellen. Zudem internalisierten sie 30-100 Mal so viele Liposomen wie die humanen und bovinen Endothelzellen, die aus gesunden Organen isoliert worden waren. Somit wurden durch die Endothelzellen eines Tumorgefäßbettes mehr Liposomen gebunden und internalisiert als durch Endothelzellen gesunden Ursprungs. Mit größerer Inkubationsdauer nahm die Internalisierung kationischer Liposomen in allen drei Endothelzellkulturen stetig zu. Dahingegen war die Bindung der kationischen Liposomen in den eingesetzten Kulturen im zeitlichen Verlauf unterschiedlich, die humanen Endothelzellen banden stetig mehr Liposomen, bei den bovinen Endothelzellen schwankte die Bindung und bei den murinen Endothelzellen wurde schnell ein Bindungsplateau erreicht, es gab im zeitlichen Verlauf keine vermehrte Bindung kationischer Liposomen. Internalisierte Liposomen in intrazellulären Vesikeln der Zellen waren sowohl elektronen- als auch fluoreszenzmikroskopisch aufzufinden, sie waren mittels Endozytose aufgenommen worden. Die bovinen Endothelzellen wiesen Liposomen an Caveolae auf, somit könnte hier eine Caveolae-vermittelte Endozytose für die Aufnahme verantwortlich sein. Bei den murinen Endothelzellen schien eine nicht-selektive Endozytose für die Internalisierung verantwortlich zu sein, es gab keine Anzeichen von Liposomen an Caveolae oder Clathrin-coated pits. Es sind also in den verschiedenen Endothelzellkulturen unterschiedliche Mechanismen der Endozytose für die Internalisierung verantwortlich. Somit konnte mit den hier verwendeten Endothelzellkulturen demonstriert werden, dass Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs auch Unterschiede in ihrer Interaktion mit den eingesetzten kationischen Liposomen aufweisen. Zudem fanden sich elektronenmikroskopisch Hinweise auf eine Fusion kationischer Liposomen mit der äußeren Zellmembran. Die Liposomen erreichten keine anderen Zellorganellen. Die Untersuchungen zur Apoptoseinduktion durch Inkubation mit kationischen Liposomen ergaben, dass einzig bei den murinen Endothelzellen eine gesteigerte Apoptoserate und das Auftreten von Nekrosen nach Liposomeninkubation beobachtet werden konnte. Dies legte die Vermutung nahe, dass einzig durch die murinen Endothelzellen ausreichend Liposomen aufgenommen wurden, um eine Zellschädigung zu verursachen. Für den Einsatz kationischer Liposomen im Rahmen des Drug Targeting in vivo bedeutet dies, dass die kationischen Liposomen die zytotoxische Wirkung eines transportierten Chemotherapetikums durch ihre eigene Zytotoxizität unterstützen können. Sollten Endothelzellen außerhalb des Gefäßbettes des Tumors vermehrt kationische Liposomen aufnehmen, so könnten auch gesunde Gewebe geschädigt werden.
Liposomes have been the target of a large number of studies in the last decade. They have been established as vectors for Drug Targeting. Cationic liposomes have been shown to selectively target endothelial cells in tumour vessels, thus they have been intensively studied for neovascular targeting in anti-angiogenic tumour therapy. The aim of this study was to evaluate the uptake of cationic liposomes by proliferating microvascular endothelial cells of different origin in vitro. Common features and differences of liposomal binding and uptake by tumour-transformed endothelial cells and endothelial cells derived from healthy organs should be examined. The endothelial glycocalyx was characterized for the used endothelial cell cultures. The glycocalyx is a mediator of multiple cellular mechanisms of uptake and thus might be a possible factor influencing liposomal uptake by endothelial cells. Furthermore, during incubation studies for qualitative and quantitative liposomal uptake evidence for cytotoxicity was observed, hence the incidence of increased apoptosis as an example of cell death was examined. Endothelial cells derived from healthy organs and tumour-derived endothelial cells (bovine endothelial cells from the corpus luteum in regression (BCl Rcobble), human dermal microvascular endothelial cells (HMVEC) and spontaneously tumour- transformed murine heart endothelial cells (MHEC5) were incubated with cationic liposomes and examined by phase contrast, fluorescence, and electron microscopy. Furthermore, fluorescence measurements for quantification of liposomal binding and uptake were performed. After cell incubation with liposomes, Apo-Annexin V-tests for detection of apoptosis were carried out. Special staining techniques were used to visualize endothelial cell glycocalyx with electron microscopy. The endothelial glycocalyx could be visualized in all endothelial cell cultures. Glycocalyx mean height was about 10-30 nm for all cell cultures but characteristic differences in shape could be detected for the different cell cultures. HMVEC glycocalyx was uniform and smooth. BCl Rcobble glycocalyx was interrupted for some cells, whereas MHEC5 and HMVEC glycocalyx was continuous. MHEC5 and BCl Rcobble glycocalyx was uniform and smooth in some parts. In other parts it appeared rough with conglomerates towering above the basic glycocalyx. These parts of rough glycocalyx were often observed at the luminal cell side at cell protrusions. To evaluate the mechanisms of liposomal uptake by endothelial cells, labelled liposomes were used for fluorescence and electron microscopic studies. In all experiments binding and uptake of liposomes by proliferating microvascular endothelial cells was observed. Differences in binding and uptake mechanisms for the evaluated endothelial cell cultures could be observed. As shown by quantitative fluorescence studies, binding and uptake by murine endothelial cells (spontaneously tumour-transformed) was higher than binding and uptake by HMVEC and BCl Rcobble (both derived from healthy tissue). Binding was approximately 10 times higher for MHEC5 compared to BCl Rcobble and HMVEC, uptake by MHEC5 far exceeded uptake by HMVEC and BCl Rcobble, being approximately 30-100 times higher. The amount of internalized liposomes was time-dependent, increasing with prolonged incubation times for all three cell cultures. The amount of binding was time-dependent for HMVEC, also increasing with prolonged incubation, but uniform for MHEC5. For BCl Rcobble, the amount of bound liposomes fluctuated with prolonged incubation. Internalized liposomes in intracellular vesicles were visible in both electron and fluorescence microscopic studies. Uptake of those liposomes was due to endocytosis. Endocytosis mechanisms are different for the investigated cell cultures. In BCl Rcobble cultures, liposomes were visible in caveolae, hence caveolae-mediated endocytosis seems to be a mechanism of liposomal uptake by BCl Rcobble. For MHEC5 there were no indications that caveolae or clathrin- coated pits were involved in endocytosis, therefore unspecific endocytosis must be held responsible for liposomal uptake by MHEC5. Another detected way of liposomal uptake was fusion with the outer cell membrane, evidence for fusion was found in electron microscopy studies. No association of cationic liposomes with other cell organelles was observed. Apoptosis studies showed increased rate of apoptosis and occurrence of necrosis after incubation with cationic liposomes only for MHEC5. Since uptake of liposomes by MHEC5 was much higher than uptake by BCl Rcobble and HMVEC it is likely that only MHEC5 cells internalized an adequate amount of liposomes to induce cell death. For the application of cationic liposomes for drug targeting in vivo this implicates that the cytotoxic potential of cationic liposomes might enhance the cytotoxic effect of a transported chemotherapeutic agent. Also, if uptake occurs by non- tumour endothelial cells, damage to healthy tissue might occur.
