dc.contributor.author
Backhaus, Sophie, geb. Hansen
dc.date.accessioned
2018-06-08T02:01:05Z
dc.date.available
2010-12-13T09:45:32.317Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13911
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-18109
dc.description.abstract
Liposomen waren in den letzten Jahren Fokus intensiver Forschungen und haben
sich insbesondere als Vektoren im Rahmen des Drug Targeting etabliert. Für
kationische Liposomen konnte eine Anreicherung in den Endothelzellen des
Tumorgefäßbettes nachgewiesen werden, so dass sie im Rahmen eines
neovaskulären Targetings zur antiangiogenen Tumortherapie intensiven
Forschungen unterzogen wurden und werden. Ziel dieser Arbeit war es, die
Aufnahme kationischer Liposomen durch proliferierende mikrovaskuläre
Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs in vitro zu untersuchen, um
Gemeinsamkeit und Unterschiede in der Prozessierung kationischer Liposomen
zwischen Endothelzellen aus gesunden Organen und aus Tumoren aufzudecken. Die
Glykokalix als Vermittler vieler zellulärer Aufnahmemechanismen sollte für die
eingesetzten Endothelzellkulturen charakterisiert werden, um Hinweise zu
erhalten, ob sie Einfluss auf die Aufnahme kationischer Liposomen haben
könnte. Darüber hinaus deutete sich in den durchgeführten Versuchen zur
qualitativen und quantitativen Untersuchung der Aufnahme an, dass die
Liposomen ein zytotoxisches Potential besitzen. Aus diesem Grunde wurden
Untersuchungen zur Induktion der Apoptose durch Inkubation kationischer
Liposomen mit proliferierenden Endothelzellen durchgeführt, um dieses Phänomen
näher zu charakterisieren. Zum Einsatz kamen Endothelzellen, die aus gesunden
Organen isoliert worden waren (Endothelzellen aus dem bovinen Corpus luteum in
Regression; BCl Rcobble), Endothelzellen aus der Haut eines Menschen; HMVEC)
ebenso wie eine Endothelzellkultur, die spontan transformiert war (MHEC5,
isoliert aus dem Herzmuskel einer Maus). Es wurden phasenkontrast-,
fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zur
Liposomeninkubation ebenso wie Apoptosetests nach Liposomeninkubation und
spezielle Färbungen der Glykokalix für elektronenmikroskopische Untersuchungen
durchgeführt. In diesen Studien wurde erstmals die Glykokalix der hier
eingesetzten Endothelzellkulturen in vitro charakterisiert. An allen Zellen
ließ sich die Glykokalix mit einer durchschnittlichen Höhe von 10-30 nm
deutlich darstellen, jedoch unterschieden sich die Endothelzellen hinsichtlich
der Ausprägung der Glykokalix. Die humanen Endothelzellen wiesen eine
gleichmäßig hohe Glykokalix auf. Im Vergleich dazu war die Glykokalix muriner
und boviner Endothelzellen an einigen Stellen von Konglomeraten überragt und
somit unregelmäßig hoch und aufgeraut, in der Grundhöhe jedoch vergleichbar
der Glykokalix humaner Endothelzellen. Diese aufgeraute Glykokalix trat
insbesondere auf der luminalen Seite der Zellen an Zellausläufern auf. Am
auffälligsten war, dass bei den bovinen Endothelzellen die Glykokalix
stellenweise unterbrochen war, während sie bei den murinen und humanen
Endothelzellen die Zellen vollständig umgab. Zur Untersuchung der
Aufnahmemechanismen der Liposomen durch die Endothelzellen wurden markierte
Liposomen für fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Studien eingesetzt. In
allen Studien wurden die Liposomen durch die eingesetzten Endothelzellen
gebunden und internalisiert, jedoch waren Unterschiede zwischen den Kulturen
auffällig. Quantitativ nahmen die murinen Endothelzellen, die spontan
transformiert waren, am meisten kationische Liposomen auf, sie banden bis zu
10 Mal so viele Liposomen wie die humanen und die bovinen Endothelzellen.
Zudem internalisierten sie 30-100 Mal so viele Liposomen wie die humanen und
bovinen Endothelzellen, die aus gesunden Organen isoliert worden waren. Somit
wurden durch die Endothelzellen eines Tumorgefäßbettes mehr Liposomen gebunden
und internalisiert als durch Endothelzellen gesunden Ursprungs. Mit größerer
Inkubationsdauer nahm die Internalisierung kationischer Liposomen in allen
drei Endothelzellkulturen stetig zu. Dahingegen war die Bindung der
kationischen Liposomen in den eingesetzten Kulturen im zeitlichen Verlauf
unterschiedlich, die humanen Endothelzellen banden stetig mehr Liposomen, bei
den bovinen Endothelzellen schwankte die Bindung und bei den murinen
Endothelzellen wurde schnell ein Bindungsplateau erreicht, es gab im
zeitlichen Verlauf keine vermehrte Bindung kationischer Liposomen.
Internalisierte Liposomen in intrazellulären Vesikeln der Zellen waren sowohl
elektronen- als auch fluoreszenzmikroskopisch aufzufinden, sie waren mittels
Endozytose aufgenommen worden. Die bovinen Endothelzellen wiesen Liposomen an
Caveolae auf, somit könnte hier eine Caveolae-vermittelte Endozytose für die
Aufnahme verantwortlich sein. Bei den murinen Endothelzellen schien eine
nicht-selektive Endozytose für die Internalisierung verantwortlich zu sein, es
gab keine Anzeichen von Liposomen an Caveolae oder Clathrin-coated pits. Es
sind also in den verschiedenen Endothelzellkulturen unterschiedliche
Mechanismen der Endozytose für die Internalisierung verantwortlich. Somit
konnte mit den hier verwendeten Endothelzellkulturen demonstriert werden, dass
Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs auch Unterschiede in ihrer
Interaktion mit den eingesetzten kationischen Liposomen aufweisen. Zudem
fanden sich elektronenmikroskopisch Hinweise auf eine Fusion kationischer
Liposomen mit der äußeren Zellmembran. Die Liposomen erreichten keine anderen
Zellorganellen. Die Untersuchungen zur Apoptoseinduktion durch Inkubation mit
kationischen Liposomen ergaben, dass einzig bei den murinen Endothelzellen
eine gesteigerte Apoptoserate und das Auftreten von Nekrosen nach
Liposomeninkubation beobachtet werden konnte. Dies legte die Vermutung nahe,
dass einzig durch die murinen Endothelzellen ausreichend Liposomen aufgenommen
wurden, um eine Zellschädigung zu verursachen. Für den Einsatz kationischer
Liposomen im Rahmen des Drug Targeting in vivo bedeutet dies, dass die
kationischen Liposomen die zytotoxische Wirkung eines transportierten
Chemotherapetikums durch ihre eigene Zytotoxizität unterstützen können.
Sollten Endothelzellen außerhalb des Gefäßbettes des Tumors vermehrt
kationische Liposomen aufnehmen, so könnten auch gesunde Gewebe geschädigt
werden.
de
dc.description.abstract
Liposomes have been the target of a large number of studies in the last
decade. They have been established as vectors for Drug Targeting. Cationic
liposomes have been shown to selectively target endothelial cells in tumour
vessels, thus they have been intensively studied for neovascular targeting in
anti-angiogenic tumour therapy. The aim of this study was to evaluate the
uptake of cationic liposomes by proliferating microvascular endothelial cells
of different origin in vitro. Common features and differences of liposomal
binding and uptake by tumour-transformed endothelial cells and endothelial
cells derived from healthy organs should be examined. The endothelial
glycocalyx was characterized for the used endothelial cell cultures. The
glycocalyx is a mediator of multiple cellular mechanisms of uptake and thus
might be a possible factor influencing liposomal uptake by endothelial cells.
Furthermore, during incubation studies for qualitative and quantitative
liposomal uptake evidence for cytotoxicity was observed, hence the incidence
of increased apoptosis as an example of cell death was examined. Endothelial
cells derived from healthy organs and tumour-derived endothelial cells (bovine
endothelial cells from the corpus luteum in regression (BCl Rcobble), human
dermal microvascular endothelial cells (HMVEC) and spontaneously tumour-
transformed murine heart endothelial cells (MHEC5) were incubated with
cationic liposomes and examined by phase contrast, fluorescence, and electron
microscopy. Furthermore, fluorescence measurements for quantification of
liposomal binding and uptake were performed. After cell incubation with
liposomes, Apo-Annexin V-tests for detection of apoptosis were carried out.
Special staining techniques were used to visualize endothelial cell glycocalyx
with electron microscopy. The endothelial glycocalyx could be visualized in
all endothelial cell cultures. Glycocalyx mean height was about 10-30 nm for
all cell cultures but characteristic differences in shape could be detected
for the different cell cultures. HMVEC glycocalyx was uniform and smooth. BCl
Rcobble glycocalyx was interrupted for some cells, whereas MHEC5 and HMVEC
glycocalyx was continuous. MHEC5 and BCl Rcobble glycocalyx was uniform and
smooth in some parts. In other parts it appeared rough with conglomerates
towering above the basic glycocalyx. These parts of rough glycocalyx were
often observed at the luminal cell side at cell protrusions. To evaluate the
mechanisms of liposomal uptake by endothelial cells, labelled liposomes were
used for fluorescence and electron microscopic studies. In all experiments
binding and uptake of liposomes by proliferating microvascular endothelial
cells was observed. Differences in binding and uptake mechanisms for the
evaluated endothelial cell cultures could be observed. As shown by
quantitative fluorescence studies, binding and uptake by murine endothelial
cells (spontaneously tumour-transformed) was higher than binding and uptake by
HMVEC and BCl Rcobble (both derived from healthy tissue). Binding was
approximately 10 times higher for MHEC5 compared to BCl Rcobble and HMVEC,
uptake by MHEC5 far exceeded uptake by HMVEC and BCl Rcobble, being
approximately 30-100 times higher. The amount of internalized liposomes was
time-dependent, increasing with prolonged incubation times for all three cell
cultures. The amount of binding was time-dependent for HMVEC, also increasing
with prolonged incubation, but uniform for MHEC5. For BCl Rcobble, the amount
of bound liposomes fluctuated with prolonged incubation. Internalized
liposomes in intracellular vesicles were visible in both electron and
fluorescence microscopic studies. Uptake of those liposomes was due to
endocytosis. Endocytosis mechanisms are different for the investigated cell
cultures. In BCl Rcobble cultures, liposomes were visible in caveolae, hence
caveolae-mediated endocytosis seems to be a mechanism of liposomal uptake by
BCl Rcobble. For MHEC5 there were no indications that caveolae or clathrin-
coated pits were involved in endocytosis, therefore unspecific endocytosis
must be held responsible for liposomal uptake by MHEC5. Another detected way
of liposomal uptake was fusion with the outer cell membrane, evidence for
fusion was found in electron microscopy studies. No association of cationic
liposomes with other cell organelles was observed. Apoptosis studies showed
increased rate of apoptosis and occurrence of necrosis after incubation with
cationic liposomes only for MHEC5. Since uptake of liposomes by MHEC5 was much
higher than uptake by BCl Rcobble and HMVEC it is likely that only MHEC5 cells
internalized an adequate amount of liposomes to induce cell death. For the
application of cationic liposomes for drug targeting in vivo this implicates
that the cytotoxic potential of cationic liposomes might enhance the cytotoxic
effect of a transported chemotherapeutic agent. Also, if uptake occurs by non-
tumour endothelial cells, damage to healthy tissue might occur.
en
dc.format.extent
XI, 125 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
uptake mechanisms
dc.subject
endothelial cells
dc.subject
electron microscopy
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Untersuchungen zur Interaktion kationischer Liposomen mit mikrovaskulären
Endothelzellen in vitro unter besonderer Berücksichtigung der endothelialen
Glykokalix und der liposomalen Zytotoxizität
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Johanna Plendl
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Heidrun Fink
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Achim Gruber
dc.date.accepted
2009-12-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000019997-5
dc.title.translated
Studies on the interaction of cationic liposomes with microvascular
endothelial cells in vitro in consideration of the endothelial glycocalyx and
liposomal cytoxicity
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000019997
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag
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FUDISS_derivate_000000008622
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open access