Die photoinduzierte Primärreaktion der Retinalproteine Halorhodopsin (HR) und Bakteriorhodopsin (bR), die mit einer all-trans- zu 13-cis-Isomerisierung des Retinalchromo-phors um dessen C13=C14-Doppelbindung verbunden ist (HR600 � bzw. bRK- Produktent-stehung), wurde mit transienter IR- Schwingungsspektroskopie bei einer Zeitauflösung von ca. 240 fs und einer spektralen Auflösung von 3 cm-1 bis 5 cm-1 und mit optischer Spektroskopie untersucht. Die Messungen mit optischer fs-Spektroskopie zeigen, dass die Primärreaktion von HR durch die drei Zeitkonstanten 6.6(8) ps, 1.5(3) ps und 0.3(1) ps bestimmt ist; der Zerfall des elektronisch angeregten Zustandes S1 hat dabei eine Dynamik, die durch die ersten beiden Zeitkonstanten charakterisiert ist. Die S1-Dynamik von bR läuft dagegen nur mit einer Zeitkonstante von ~ 0.5 ps ab [Herbst2002/I][Herbst2002/II]. Da der Ausgangszustand des HR heterogen ist (~ 83 % Spezies mit all-trans- und ~ 17 % mit (13-cis, 15-syn)-Konfiguration des Retinalchromophors), stellt sich die Frage, ob jeweils einer Spezies eine Zeitkonstante zugeordnet ist, oder ob beide Zeitkonstanten von der Dynamik nur einer Spezies stammen. Eine weitere Frage ist die Zuordnung einer Zeitkonstante zur HR600 -Produktentstehung. Wir haben daher zum ersten Mal transiente IR-Schwingungs-spektroskopie an hydratisierten HR-Filmen durchgeführt, mit dem Vorteil gegenüber der optischen fs-Spektroskopie der spektral schmalen und mannigfaltigen IR-Banden, an denen sich direkt die strukturelle Dynamik beobachten lässt. An der zeitlichen Entwicklung der Markerbanden (C-C-Streckschwingungen: 1135 cm-1 - 1230 cm-1) für einen Chromophor, der in 13-cis-Konfiguration vorliegt, zeigte sich, dass die HR600 �Entstehung mit der Zeit-konstante 1.8(1) ps geschieht. Im Bereich der C=C-Streckschwingungen entstanden HR600 -Produktbanden mit 2.2(1) ps. Die Wiederkehr des Ausgangszustandes ist durch die lange Zeitkonstante 7.7(5) ps aber auch durch Anteile an der 2.0(1) ps-Konstante (gemittelte Werte) bestimmt. Diese Zeiten sind mit denen aus den optischen Messungen als konsistent zu betrachten. Bei Variation der Anregungswellenlänge zeigte sich, dass die zwei Zeitkonstanten 2 ps und 7.7 ps nur zur all-trans-Spezies des Ausgangszustandes gehören. Die Dynamik der Proteinumgebung im Amid-II-Bereich um 1552 cm-1 zeigt ein mit 2.6(9) ps verzögertes Bleichsignal, das mit 13(5) ps zerfällt (HR). Interessant ist, dass sowohl beim HR als auch beim bR die Entstehungszeit der Bleichbande um 1552 cm-1 mit der Zerfallszeit des S1 (bR) bzw. der reaktiven Spezies im S1 (HR) übereinstimmt. Das weist auf eine durch die Isomerisierung bewirkte sterische Wechselwirkung des Chromophors mit der Proteinumgebung hin. Ein weiterer Grund für den verzögerten Anstieg kann sein, dass das durch den Pumppuls induzierte Dipolfeld zu einer modifizierten Ladungsverteilung in der Nähe des Chromophors führt. Dadurch ändern sich Schwingungsübergänge von geladenen Aminosäuren, der Schiffschen Base oder H2O. Eine anfängliche Verdrillung des Retinalchromophors ist eine andere Erklärung. Weiterführende Messungen an bR zeigten, dass die breite HOOP-Differenzbande um 963 cm-1 (Verdrillungsdynamik des Chromophors) mit 0.6(1) ps entsteht, was die Ergebnisse von Herbst et al. eines vollständig isomerisierten Chromophors bereits im J-Zustand bestätigt [Herbst2002/I][Herbst2002/II]. Die HOOP-Bande zerfällt mit 25(17) ps. Die Ähnlichkeit zur Proteindynamik weist auf eine Wechselwirkung zwischen Verdrillung und dem Protein hin. Eine dynamische Wechselwirkung des Chromophors mit der Proteinumgebung zeigt sich um 1649 cm-1. Bei H2O-bR liegt an dieser Position eine Bleichbande zu späten Zeiten, beim D2O-bR nicht. Eine Erklärung ist, dass beim H2O-bR durch die 13-cis- Isomerisierung ein H2O-Molekül aus der Nähe der Chromophor-Bindungsstelle in eine andere elektrostatische Umgebung verschoben wird, so dass sich die Frequenz seiner Biegeschwingung (1649 cm-1) verändert. An den Farbstoffen p-DPD-b13 und DASPI wurden Messungen mit fs IR-Schwingungs-spektroskopie durchgeführt. Die polymethinische Theorie sagt einen stufenlosen Übergang von Doppel- zu Einfachbindungen nach Photoanregung und durch das substituenten- induzier-te Feld voraus. Bei einem hohen Feld verschiebt sich beim Übergang S0?S1 die Frequenz der C=C-Streckschwingung zu höheren Wellenzahlen, was auf einen stärkeren Doppelbindungs-charakter im S1 für die zentrale Bindung schließen lässt. Für DASPI lag die Verschiebung bei + 13(2) cm-1 (theoretischer Wert + 11 cm-1). Überträgt man die Ergebnisse auf andere Farb- stoffe wie z. B. HR oder bR, so ist ein Erklärungsansatz für die Frage gefunden, ob neben der C13=C14-Doppelbindung auch Einfachbindungen bei der 13 -cis-Isomerisierung eine Rolle spielen [Liu1985][Liu2000][Liu2001]. Auch stellen die Ergebnisse eine Basis dar, die Frequenz der C=C-Streckschwingung im S1 und den Opsinshift zu berechnen [Sczepan2003]. Erste, aussichtsreiche Experimente mit fs IR-Schwingungsspektroskopie wurden an Sensorrhodopsin II durchgeführt. Man kann hierbei die Photoreaktion eines Retinalchromophors in einer etwas anderen Proteinumgebung untersuchen.
The all-trans- to 13-cis-isomerization of the retinal chromophore in the light-driven chloride ion-pump halorhodopsin (HR) was studied for the first time with femtosecond time resolved mid-infrared vibrational spectroscopy at a time resolution of about 220 fs. Transient vibrational spectroscopy has been proven to be a reliable tool for investigating ultrafast vibrational dynamics in biological systems: For bacteriorhodopsin (bR) it could be shown that the all-trans- to 13-cis-isomerization is already completed within 500 fs [Herbst2002]. One of the advantages of transient vibrational spectroscopy in comparison to optical spectroscopy are the numerous and narrow infrared difference-bands. At sufficient spectral resolution thus one can directly distinguish between the rise of product-bands and the recovery of educt-bands. With transient vibrational spectroscopy we can gain inside to processes associated with protein-based photoreactions, as structural changes of the chromophore, its vibrational relaxation and the concomitant dynamics of the protein environment. The vibrational dynamics for HR shows two time constants, i.e. 2 and 7.7 ps. The time constant of the 13-cis product (HR-K)-formation was found to be the short time constant 2 ps. On the basis of our results we could develop a reaction scheme for the chromophore kinetics in agreement with Arlt et al. [Arlt1995]. Further we have researched the dynamics of �hydrogen- out-of-plane� (HOOP)-vibrations of bR. The formation of HOOP-bands around 960 cm-1 shows a time-constant 0.6 (1) ps, comparable to the time for the rise of the characteristic 13-cis-product-band of the C-C-stretching-mode at 1195 cm-1. That is an alternative prove for the fast formation of the 13-cis- photoproduct. In bR many processes after photoexcitation are spectrally and temporally superimposed. One way to unravel processes like isomerization of the retinal chromophore, dynamics in the electronically excited state, vibrational relaxation (�vibrational cooling�) as well dynamical interaction with the protein environment is to substitute water in bR with deuterium oxide (D2O). We have examined the reaction dynamics of the dyes p-DPD-b13 und DASPI. Theoretical predictions on the basis of the polymethinic theory for the shift of the spectral position of a C=C-stretching-mode at the S0->S1 transition could be proven in our experiments. In principal we can use these results to calculate the shift also for HR or bR. First experiments were done on sensorrhodopsin SR-II. [Herbst2002] Herbst. J., Heyne, K., Diller, R. (2002) Science, 297, 822-825. [Arlt1995] Arlt, T., Schmidt, S., Zinth, W., Haupts, U., Oesterhelt, D. (1995) Chem. Phys. Lett., 241, 559-565.
