Ubiquitin (Ub) and ubiquitin-like proteins (UbLs) are posttranslational protein modifiers which affect a pleiotropy of cellular functions. Deubiquitinating enzymes (DUBs) counteract these modifications and it is emerging that the deconjugation of Ub and UbLs also is a highly regulated process of great physiological importance. Moreover, as being proteases which belong to the group of proven 'drugable' molecules DUBs are attractive for pharmacological intervention and have been linked to pathological abnormalities and cancer. However, the physiological relevance and in vivo functions of individual DUBs are poorly defined as mouse models are only available for a limited number of these Ub/UbL deconjugating enzymes at this time. In this study, two mouse models were generated via gene targeting in embryonic stem cells: a knockin mouse model in which USP18 is replaced by an enzymatically inactive variant and a conditional knockout of Usp15 which allows the deletion of USP15 in a temporal and spatial manner. USP18 is the main isopeptidase counteracting ISG15 modification of target proteins (ISGylation). The ISG15 modification system is one of the major interferon effector systems and an important player in higher eukaryotes against pathogens. Usp18 knockout animals display severe brain injury, are hyperresponsive to IFN stimulation, die prematurely, were reported to be more resistant against certain infections, and have a higher ISGylation levels after interferon stimulation. Primarily loss of ISG15 deconjugation was alluded to be the main cause for these phenotypical alterations. However, Isg15 knockout mice develop normally. Interestingly, Isg15 Usp18 double knockout mice do not differ from Usp18 knockout mice and also a protease independent function of USP18 was described raising the question which alteration can be ascribed to protease or nonprotease functions of USP18. Thus, severe brain injury and hyperresponsiveness to IFN is not connected to ISG15. To clearly discriminate isopeptidase dependent from isopeptidase independent function, a novel mouse strain was generated by gene targting in which the endogenous USP18 lacks protease function. Additionally, this knockin mouse model serves as a valuable model to mimick the physiological consequences of selective USP18 protease inhibition. Based on cell culture experiments USP15 has been reported to affect NFkappaB and TGF-beta signaling suggesting an important role of USP15 in immunity and development. Moreover, in vitro experiments alluded USP15 to stabilize RBX1, a component of nearly all cullin Ub E3 ligases recruiting the E2 enzyme for Ub conjugation. USP15 associates with the CSN, a protein complex which regulates the activity of these ligases. To gain insight into the role of USP15 within the context of the whole organism a conditional knockout mouse strain was planned and generated via gene targeting in embryonic stem cells. Knockout animals were born at expected mendelian ratio and were growth retarded. To challenge previous observations and to relate them in a physiological context, TGF-beta and NFkappaB signaling was monitored in fibroblasts generated from USP15 deficient and wildtype mice. In contrast to previous reports, lack of USP15 did alter neither kinetics nor intensity of TGF-beta induced SMAD2 phosphorylation. Likewise, there was no inhibition of TNF-alpha induced IkappaBalpha reaccumulation in fibroblasts as has been reported from USP15 knockdown experiments. Furthermore, RBX1 levels were not altered in Usp15 knockout fibroblasts. Hence, at least in fibroblasts USP15 is not essential for TGF-beta, TNF-alpha signaling, and RBX1 stability under the experimental conditions employed. Moreover, loss of USP15 did not change protein levels of the CSN subunits CSN5 or CSN8. The generated conditional mouse strain provides a valuable tool to investigate the physiological role of USP15 in a temporal and spatial manner. The generated conditional Usp15 gene knockout gives the opportunity to analyze USP15 function either in specific cell types (e.g., CD4+) or to induce deletion of Usp15 in adult animals using an Mx1-cre deleter strain.
Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-ähnliche Proteine (UbLs) dienen als posttranslationelle Modifikatoren von Proteinen und beeinflussen eine Fülle von zellulären Funktionen. Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) wirken der Modifikation mit Ub/UbL durch dessen Abspaltung bzw. Dekonjugation entgegen. Inzwischen wird klar, dass der Prozess der Dekonjugation ein genau regulierter Vorgang von groÿer physiologischer Bedeutung ist. Da Proteasen als pharmakologisch intervenierbar gelten und DUBs mit pathologischen Anomalien und Krebs in Verbindung gebracht wurden, sind sie attraktiv für die Entwicklung solcher Inhibitoren. Leider ist die physiologische Relevanz und Funktion vieler DUBs in vivo nicht bekannt, da entsprechende Mausmodelle nicht zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit wurden zwei Mausmodelle für DUBs mittels gezielter Mutagenese von embryonalen Stammzellen hergestellt: ein knockin Mausmodell in welchem USP18 durch eine enzymatisch inaktive Variante ersetzt wurde und ein konditioneller knockout von USP15, welcher eine zeitliche oder räumliche Deletion dieses Genes erlaubt. USP18 ist die Hauptisopeptidase, die der Proteinmodifikation durch ISG15 (ISGylierung) entgegenwirkt. Die ISGylierung ist eine der Haupteffektoren des Interferonsystems und daher wichtig bei der Bekämpfung von Pathogenen in höheren Eukaryoten. Usp18 defiziente Mäuse zeigen starke Gehirnanomalien, überreagieren auf Interferonstimulation, sterben frühzeitig, sind resistenter gegenüber bestimmten Infektionen und zeigen eine vermehrte ISGylierung nach Interferonstimulation. Anfänglich wurde der Verlust der Dekonjugation von ISG15 als Ursache dieser phänotypischen Veränderungen angenommen. Da sich jedoch Isg15 defiziente Mäuse normal entwickeln und Isg15/Usp18 Doppel- Knockout-Mäuse phänotypisch nicht von Usp18 defizienten Tieren zu unterscheiden sind stellt sich die Frage, welche phänotypische Veränderung der Proteasefunktion zuzuschreiben und welche davon unabhängig ist. Experimente deuteten bereits auch auf eine Protease-unabhängige Funktion von USP18 hin. Daher wurde ein neues Mausmodell mittels gezielter Mutagenese von embryonalen Stammzellen hergestellt, welchem die Proteasefunktion des endogenen USP18 fehlt. Darüber hinaus dient dieses Mausmodell als ein wertvolles Werkzeug, um die physiologische Konsequenz einer selektiven Inhibition der enzymatischen Funktion von USP18 zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass USP15 den NFkappaB und TGF-beta Signalweg beeinflusst und deutet daher auf eine Rolle von USP15 in Immunität und Entwicklung hin. Darüber hinaus lieÿen in vitro Experimente auf eine Stabilisierung von RBX1, eine Komponente von fast allen Cullin Ub E3 RING Ligasen, durch USP15 schlieÿen. USP15 bindet auÿerdem an das CSN, ein Proteinkomplex welcher diese Ligasen reguliert. Um die Rolle von USP15 in vivo zu analysieren, wurde ein konditionelles Usp15 Knockout-Mausmodell mittels gezielter Mutagenese von embryonalen Stammzellen, geplant und hergestellt. Usp15 defiziente Mäuse sind lebensfähig, werden nach mendelscher Verteilung geboren und sind Wachstumsverzögert. Um zuvor gemachte Beobachtungen im physiologischen Kontext zu bewerten wurde der TGF-beta and NFkappaB Signalweg untersucht. Diese Analysen wurden an Fibroblasten durchgeführt, welche aus USP15 defizienten bzw. Wildtyp-Mäusen hergestellt wurden. Im Gegensatz zu publizierten Beobachtungen führte der Verlust von USP15 zu keiner Veränderung der SMAD2 Phosphorylierung nach TGF-beta Stimulation, weder in dessen Kinetik noch Intensität. Gleichermaÿen verhielt es sich, entgegen eines Berichtes, mit der Reakkumulation von IkappaBalpha nach TNF-alpha Stimulation, da ebenfalls keine Veränderung in USP15 defizienten Zellen festzustellen war. Desweiteren führte der Verlust von USP15 zu keiner Reduktion von endogenem RBX1. Folglich spielt USP15 zumindest in Fibroblasten für den TGF-beta, TNF-alpha Signalweg und die Stabilität von RBX1, unter den angewandeten experimentellen Bedingungen, keine Rolle. Zudem waren in USP15 defizienten Zellen die Proteinmengen der CSN Untereinheiten CSN5 und CSN8 unverändert. Der generierte konditionelle Mausstamm stellt ein wertvolles und vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung der physiologischen Rolle von USP15 dar. Durch den konditionellen Charakter lässt sich USP15 in spezifischen Zelltypen (z. B. CD4+) oder induzierbar in adulten Tieren mittels der Verwendung von Mx-cre Transgenen deletieren.
