dc.contributor.author
Hannß, Ronny
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:03:38Z
dc.date.available
2012-10-29T10:47:08.450Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9995
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14193
dc.description
Zusammenfassung ix Summary xi 1\. Introduction 1 1.1. Ubiquitin and ubiquitin-
like proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2. Processing,
conjugation and deconjugation . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.3. Regulation
mediated by Ub- and UbL-deconjugating enzymes . . . . 5 1.4. The ubiquitin-
like modifier ISG15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.5. Function of
ISG15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.6. USP18
function in vitro and in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.6.1.
USP18 as an isopeptidase for ISG15 . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.6.2.
USP18 in IFN signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.7. USP15
function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.7.1.
USP15 is a Ub-specific isopeptidase . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.7.2.
USP15 is implicated in diverse cellular processes . . . . . . . . 15 1.7.3.
USP15 in cell signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.8.
Manipulation of the mouse genome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.8.1. Gene knockouts in mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.8.2. Introducing subtle mutations into the mouse genome . . . . . 23 1.8.3.
Procedure and general principles for gene targeting in mice . . 23 1.9. Aim of
this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2\.
Materials and methods 25 2.1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.1. Centrifuges . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.2. Reagents and chemicals . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 25 2.1.3. Buffers and solutions . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 27 2.1.4. Protein and DNA markers . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 31 2.1.5. Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 31 2.1.6. Primary antibodies . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 31 2.1.7. Secondary antibodies . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 32 2.1.8. Cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 32 2.1.9. Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 32 2.1.10. Equipment and devices . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 33 2.1.11. Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 34 2.1.12. Expendable materials . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 34 2.1.13. Filters and membranes . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 35 2.1.14. Media and supplements for eukaryotic cells . . . . .
. . . . . . 35 2.1.15. Media and supplements for bacteria . . . . . . . . . .
. . . . . 37 2.1.16. Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 37 2.1.17. Eukaryotic cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 37 2.1.18. Animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 37 2.1.19. Mouse genomic library . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 38 2.1.20. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 38 2.1.21. DNA primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 38 2.1.22. Colony hybridization probes . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 40 2.1.23. Southern blot probes . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 40 2.2. DNA and RNA methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 41 2.2.1. DNA isolation from eukaryotic cells and mouse tail
biopsies . 41 2.2.2. Phenol chloroform extraction . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 41 2.2.3. DNA precipitation using isopropanol . . . . . . . . . . . .
. . 41 2.2.4. DNA agarose gel electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . .
. 42 2.2.5. Isolation of DNA from agarose gels . . . . . . . . . . . . . . .
42 2.2.6. Photometric determination of DNA/RNA concentration and purity . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.2.7.
Determination of DNA concentration by agarose gel electrophoresis . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.2.8. Estimation of DNA
concentration by dot quantification . . . . 43 2.2.9. Isolation of genomic DNA
from ES cells . . . . . . . . . . . . 43 2.2.10. Preparation of plasmid DNA
from small bacterial cultures . . 44 2.2.11. Preparation of plasmid DNA from
large bacterial cultures . . 44 2.2.12. Digestion of DNA with restriction
enzymes . . . . . . . . . . . 44 2.2.13. Blunting DNA with 50protruding
termini . . . . . . . . . . . . 44 2.2.14. Dephosphorylation of DNA 50termini
. . . . . . . . . . . . . . 45 2.2.15. Ligation of DNA fragments . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 45 2.2.16. Annealing of DNA oligomeres . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 45 2.2.17. Site directed mutagenesis . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 46 2.2.18. Isolation of RNA from mammalian cells . . . . .
. . . . . . . . 46 2.2.19. Synthesis of cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 46 2.2.20. Generation of competent bacteria . . . . . . . . . .
. . . . . . 47 2.2.21. Transformation of competent E. coli by heat shock . . .
. . . 47 2.2.22. Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . .
. 48 2.2.23. Genotyping of Usp15 mutants by PCR . . . . . . . . . . . . . 48
2.2.24. Purification of DNA fragments and PCR products . . . . . . . 49
2.2.25. Southern blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2.26. Northern blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.2.27. Preparation of radiolabeled probes by single labeling . . . . . 50
2.2.28. Preparation of radiolabeled probes by double labeling . . . . . 51
2.2.29. Colony hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.30. Stripping and reprobing of colony hybridizations and Southern blots .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2.2.31.
Generation of sheared and denatured salmon sperm ssDNA . . 53 2.3. Protein
methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2.3.1.
Preparation of protein extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2.3.2.
SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) . . . . . 54 2.3.3. Western
blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.4. Cell
culture methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.4.1. Preparation of mouse embryonic fibroblasts . . . . . . . . . . 56
2.4.2. Preparation of mouse adult fibroblasts . . . . . . . . . . . . . 56
2.4.3. Stimulation of MAFs with TNF-alpha or TGF-beta . . . . . . . . . . 57
2.4.4. Cryopreservation of mammalian cells . . . . . . . . . . . . . . 57
2.4.5. Cell culture methods for ES cells . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4.6. Preparation of ES cells for blastocyst injection . . . . . . . . . 60
2.5. Bioinformatical methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 2.5.1. Primer design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 2.5.2. Design of probes for Southern blotting . . . . . . . . . . . . . 60
2.5.3. Alignments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3\. Results 62 3.1. Generation of mice expressing catalytically inactive USP18
. . . . . . 62 3.1.1. Targeting strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 62 3.1.2. Construction of Usp18 C61A targeting vector . . . . . . .
. . . 64 3.1.3. Manipulation and identification of mutated ES cells . . . . .
. 66 3.1.4. Generation of chimeric mice and identification of germline
transmission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.2.
Generation of conditional Usp15 knockout mice . . . . . . . . . . . . 69
3.2.1. Targeting strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.2. Generation of a targeting vector . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.2.3. Manipulation and identification of mutated ES cells . . . . . . 73
3.2.4. Generation of chimeric mice and identification of germline transmission
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 3.2.5. Deletion of
the neomycin resistance gene . . . . . . . . . . . . 75 3.2.6. Deletion of
Usp15 using Cre deleter mice . . . . . . . . . . . . 76 3.2.7. Design of PCRs
for genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 3.2.8. Cre-mediated
deletion of Usp15 results in a null allele . . . . . 78 3.2.9. Usp15-/- mice
are viable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.2.10. Analyses of MAFs
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 3.2.11. Loss of USP15
does not reduce protein steady state levels of the endogenous RING box protein
RBX1 . . . . . . . . . . . . 82 3.2.12. IkappaBalpha degradation and
reaccumulation is not altered in Usp15 deficient MAFs . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 83 3.2.13. TGF-beta induced SMAD2 phosphorylation
is not altered in Usp15-/- MAFs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 84 3.2.14. USP15 does not influence protein steady state levels of neither
CSN5 nor CSN8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4\.
Discussion 86 4.1. USP18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 86 4.1.1. Generation of mice expressing catalytically inactive
USP18 . . 86 4.1.2. Usp18 C61A/C61A mice as a tool to dissect enzymatic
functions in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 88 4.2. USP15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 90 4.2.1. Generation of mice carrying a conditional Usp15 allele . . .
. 90 4.2.2. Usp15 deficient mice are viable . . . . . . . . . . . . . . . . .
91 4.2.3. Usp15 deficient mice lack transcript and protein . . . . . . . . 91
4.2.4. USP15 does not reduce the endogenous protein steady state levels of the
CRL component RBX1 . . . . . . . . . . . . . . . 92 4.2.5. Reexamination of
TNF-alpha signaling . . . . . . . . . . . . . . . 93 4.2.6. Reexamination of
TGF-beta signaling . . . . . . . . . . . . . . . 94 4.2.7. USP15 has most
likely no influence on CSN stability . . . . . 95 4.2.8. Outlook . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 References 98 A. Appendix 111
A.1. List of abbreviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 112 A.2. Acknowledgment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 116 A.3. Declaration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 118 A.4. Publications, talks and posters . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 119
dc.description.abstract
Ubiquitin (Ub) and ubiquitin-like proteins (UbLs) are posttranslational
protein modifiers which affect a pleiotropy of cellular functions.
Deubiquitinating enzymes (DUBs) counteract these modifications and it is
emerging that the deconjugation of Ub and UbLs also is a highly regulated
process of great physiological importance. Moreover, as being proteases which
belong to the group of proven 'drugable' molecules DUBs are attractive for
pharmacological intervention and have been linked to pathological
abnormalities and cancer. However, the physiological relevance and in vivo
functions of individual DUBs are poorly defined as mouse models are only
available for a limited number of these Ub/UbL deconjugating enzymes at this
time. In this study, two mouse models were generated via gene targeting in
embryonic stem cells: a knockin mouse model in which USP18 is replaced by an
enzymatically inactive variant and a conditional knockout of Usp15 which
allows the deletion of USP15 in a temporal and spatial manner. USP18 is the
main isopeptidase counteracting ISG15 modification of target proteins
(ISGylation). The ISG15 modification system is one of the major interferon
effector systems and an important player in higher eukaryotes against
pathogens. Usp18 knockout animals display severe brain injury, are
hyperresponsive to IFN stimulation, die prematurely, were reported to be more
resistant against certain infections, and have a higher ISGylation levels
after interferon stimulation. Primarily loss of ISG15 deconjugation was
alluded to be the main cause for these phenotypical alterations. However,
Isg15 knockout mice develop normally. Interestingly, Isg15 Usp18 double
knockout mice do not differ from Usp18 knockout mice and also a protease
independent function of USP18 was described raising the question which
alteration can be ascribed to protease or nonprotease functions of USP18.
Thus, severe brain injury and hyperresponsiveness to IFN is not connected to
ISG15. To clearly discriminate isopeptidase dependent from isopeptidase
independent function, a novel mouse strain was generated by gene targting in
which the endogenous USP18 lacks protease function. Additionally, this knockin
mouse model serves as a valuable model to mimick the physiological
consequences of selective USP18 protease inhibition. Based on cell culture
experiments USP15 has been reported to affect NFkappaB and TGF-beta signaling
suggesting an important role of USP15 in immunity and development. Moreover,
in vitro experiments alluded USP15 to stabilize RBX1, a component of nearly
all cullin Ub E3 ligases recruiting the E2 enzyme for Ub conjugation. USP15
associates with the CSN, a protein complex which regulates the activity of
these ligases. To gain insight into the role of USP15 within the context of
the whole organism a conditional knockout mouse strain was planned and
generated via gene targeting in embryonic stem cells. Knockout animals were
born at expected mendelian ratio and were growth retarded. To challenge
previous observations and to relate them in a physiological context, TGF-beta
and NFkappaB signaling was monitored in fibroblasts generated from USP15
deficient and wildtype mice. In contrast to previous reports, lack of USP15
did alter neither kinetics nor intensity of TGF-beta induced SMAD2
phosphorylation. Likewise, there was no inhibition of TNF-alpha induced
IkappaBalpha reaccumulation in fibroblasts as has been reported from USP15
knockdown experiments. Furthermore, RBX1 levels were not altered in Usp15
knockout fibroblasts. Hence, at least in fibroblasts USP15 is not essential
for TGF-beta, TNF-alpha signaling, and RBX1 stability under the experimental
conditions employed. Moreover, loss of USP15 did not change protein levels of
the CSN subunits CSN5 or CSN8. The generated conditional mouse strain provides
a valuable tool to investigate the physiological role of USP15 in a temporal
and spatial manner. The generated conditional Usp15 gene knockout gives the
opportunity to analyze USP15 function either in specific cell types (e.g.,
CD4+) or to induce deletion of Usp15 in adult animals using an Mx1-cre deleter
strain.
de
dc.description.abstract
Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-ähnliche Proteine (UbLs) dienen als
posttranslationelle Modifikatoren von Proteinen und beeinflussen eine Fülle
von zellulären Funktionen. Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) wirken der
Modifikation mit Ub/UbL durch dessen Abspaltung bzw. Dekonjugation entgegen.
Inzwischen wird klar, dass der Prozess der Dekonjugation ein genau regulierter
Vorgang von groÿer physiologischer Bedeutung ist. Da Proteasen als
pharmakologisch intervenierbar gelten und DUBs mit pathologischen Anomalien
und Krebs in Verbindung gebracht wurden, sind sie attraktiv für die
Entwicklung solcher Inhibitoren. Leider ist die physiologische Relevanz und
Funktion vieler DUBs in vivo nicht bekannt, da entsprechende Mausmodelle nicht
zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit wurden zwei Mausmodelle für DUBs
mittels gezielter Mutagenese von embryonalen Stammzellen hergestellt: ein
knockin Mausmodell in welchem USP18 durch eine enzymatisch inaktive Variante
ersetzt wurde und ein konditioneller knockout von USP15, welcher eine
zeitliche oder räumliche Deletion dieses Genes erlaubt. USP18 ist die
Hauptisopeptidase, die der Proteinmodifikation durch ISG15 (ISGylierung)
entgegenwirkt. Die ISGylierung ist eine der Haupteffektoren des
Interferonsystems und daher wichtig bei der Bekämpfung von Pathogenen in
höheren Eukaryoten. Usp18 defiziente Mäuse zeigen starke Gehirnanomalien,
überreagieren auf Interferonstimulation, sterben frühzeitig, sind resistenter
gegenüber bestimmten Infektionen und zeigen eine vermehrte ISGylierung nach
Interferonstimulation. Anfänglich wurde der Verlust der Dekonjugation von
ISG15 als Ursache dieser phänotypischen Veränderungen angenommen. Da sich
jedoch Isg15 defiziente Mäuse normal entwickeln und Isg15/Usp18 Doppel-
Knockout-Mäuse phänotypisch nicht von Usp18 defizienten Tieren zu
unterscheiden sind stellt sich die Frage, welche phänotypische Veränderung der
Proteasefunktion zuzuschreiben und welche davon unabhängig ist. Experimente
deuteten bereits auch auf eine Protease-unabhängige Funktion von USP18 hin.
Daher wurde ein neues Mausmodell mittels gezielter Mutagenese von embryonalen
Stammzellen hergestellt, welchem die Proteasefunktion des endogenen USP18
fehlt. Darüber hinaus dient dieses Mausmodell als ein wertvolles Werkzeug, um
die physiologische Konsequenz einer selektiven Inhibition der enzymatischen
Funktion von USP18 zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass USP15 den NFkappaB
und TGF-beta Signalweg beeinflusst und deutet daher auf eine Rolle von USP15
in Immunität und Entwicklung hin. Darüber hinaus lieÿen in vitro Experimente
auf eine Stabilisierung von RBX1, eine Komponente von fast allen Cullin Ub E3
RING Ligasen, durch USP15 schlieÿen. USP15 bindet auÿerdem an das CSN, ein
Proteinkomplex welcher diese Ligasen reguliert. Um die Rolle von USP15 in vivo
zu analysieren, wurde ein konditionelles Usp15 Knockout-Mausmodell mittels
gezielter Mutagenese von embryonalen Stammzellen, geplant und hergestellt.
Usp15 defiziente Mäuse sind lebensfähig, werden nach mendelscher Verteilung
geboren und sind Wachstumsverzögert. Um zuvor gemachte Beobachtungen im
physiologischen Kontext zu bewerten wurde der TGF-beta and NFkappaB Signalweg
untersucht. Diese Analysen wurden an Fibroblasten durchgeführt, welche aus
USP15 defizienten bzw. Wildtyp-Mäusen hergestellt wurden. Im Gegensatz zu
publizierten Beobachtungen führte der Verlust von USP15 zu keiner Veränderung
der SMAD2 Phosphorylierung nach TGF-beta Stimulation, weder in dessen Kinetik
noch Intensität. Gleichermaÿen verhielt es sich, entgegen eines Berichtes, mit
der Reakkumulation von IkappaBalpha nach TNF-alpha Stimulation, da ebenfalls
keine Veränderung in USP15 defizienten Zellen festzustellen war. Desweiteren
führte der Verlust von USP15 zu keiner Reduktion von endogenem RBX1. Folglich
spielt USP15 zumindest in Fibroblasten für den TGF-beta, TNF-alpha Signalweg
und die Stabilität von RBX1, unter den angewandeten experimentellen
Bedingungen, keine Rolle. Zudem waren in USP15 defizienten Zellen die
Proteinmengen der CSN Untereinheiten CSN5 und CSN8 unverändert. Der generierte
konditionelle Mausstamm stellt ein wertvolles und vielseitiges Werkzeug zur
Untersuchung der physiologischen Rolle von USP15 dar. Durch den konditionellen
Charakter lässt sich USP15 in spezifischen Zelltypen (z. B. CD4+) oder
induzierbar in adulten Tieren mittels der Verwendung von Mx-cre Transgenen
deletieren.
de
dc.format.extent
XII, 120 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Generation and analyses of mouse models for USP18 and USP15 via gene targeting
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Wolfgang Dubiel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2012-10-12
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000039753-4
dc.title.translated
Herstellung und Analyse von Mausmodellen für USP18 und USP15 mittels
zielgerichteter Mutagenese
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000039753
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012324
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access
