The question on the number of human senses in western societies is typically answered with five. Asking people anywhere in the world, what is most annoying feeling, the majority will answer emotional, physical, or diseases related pain. Whatever reason, the answer is mostly pain. But can the perception of pain be defined as sense? The answer is yes. Pain initiating stimuli activate specialized peripheral sensory neurons from the dorsal root ganglia - the so called nociceptive neurons. One protein central for inflammatory temperature pain is the ion channel TRPV1. TRPV1 protein expression in sensory neurons is upregulated in situations of hightened pain sensitivity, suggesting a direct causal relationship between the TRPV1 expression levels and pain sensitivity. A number of processes have been identified describing the sensitization and desensitization of TRPV1 on a molecular level. But, to what extend the expression levels of TRPV1 correlates with its cellular activation kinetics on a population base has not been analyzed in detail so far. This is due to, a lack of suitable technical approaches to analyze the function and (TRPV1-) protein expression levels on a single cell base. I quantified the heterogeneity of TRPV1 expression in nociceptive neurons, with confocal and “high content screening” microscopy approaches. Antibody based expression analysis and calcium imaging identified 60.4 ± 6.5 % (immune cytochemistry) and 58.2 ± 6.8 % (capsaicin responsive cells) sensory neurons, to be TRPV1 expressing. In depth analysis of the calcium imaging experiments revealed, that submaximal capsaicin concentrations do not result in lower responses but lower numbers of capsaicin sensitive cells. Further, a correlation between TRPV1 expression and the amplitude of capsaicin induced calcium influx was clearly detectable in exogenously expressed TRPV1 transfected cell lines, but was almost absent in endogenously expressing nociceptive neurons. Pretreatment with strong sensitization inducing substances (PMA and FSK) resulted in an improvement of the correlation – nevertheless, still not explaining all the heterogeneity between expression and response. Accordingly, a sensitization signaling protein, the regulatory subunit of PKA RIIβ, correlated better with the cellular capsaicin response than TRPV1 itself. As the strong sensitization signaling did not result in a complete correlation between expression and capsaicin induced calcium influx, there must exist other mechanisms of regulation such as expression of modulators. To identify novel TRPV1 modulator and gain genetic insights into nociceptors, we developed a novel subgroup specific transcriptome analysis approach. The resulting list of up regulated genes offers the opportunity to identify novel TRPV1 and pain modulators. Furthermore, the list presents the first complete transcriptome of a subpopulation of nociceptive neurons. In collaboration with Steffen Waldherr, my results were analyzed by establishing a computational model for the cellular capsaicin sensitivity. From this model based on experimental data and literature derived values, a mechanism is suggested, which regulates the relative capsaicin sensitivity state inversely to the TRPV1 expression in sensory neurons. Thus, the TRPV1 response is surprisingly robust against changes in TRPV1 expression levels. My results question the conventional therapeutic use of TRPV1-channel blockers and suggest the need to define the cellular mechanisms how the TRPV1-mediated calcium influx-homeostasis is controlled.
Die Frage nach der Anzahl menschlicher Sinne wird in westlichen Gesellschaften typischerweise mit fünf beantwortet. Fragt man Menschen irgendwo auf der Welt nach ihrem unangenehmsten Gefühl, wird die Mehrzahl entweder mit emotionalen, physischen oder krankheitsbedingten Schmerz antworten. Auf welcher Ursache auch immer die resultierende Antwort basiert, sie ist in den meisten Fällen Schmerz. Aber kann die Wahrnehmung von Schmerz als Sinn definiert werden? Die Antwort ist ja. Schmerz verursachende Stimuli aktivieren spezialisierte sensorische Neurone aus den dorsalen Hinterwurzel Ganglien, die sogenannten Nozizeptoren. Ein zentrales Protein für entzündlichen Temperaturschmerz ist der Ionenkanal TRPV1. Unter Bedingungen erhöhter Schmerzsensitivität ist die TRPV1 Proteinexpression in nozizeptiven Neuronen erhöht. Dies deutet auf eine direkte kausale Beziehung zwischen TRPV1 Expressionsmengen und Schmerzsensitivität hin. Eine Reihe von Prozessen wurde bereits identifiziert, welche die Sensitivierung und Desensitiverung von TRPV1 auf molekularer Ebene beschreiben. In welchem Ausmaß jedoch die TRPV1 Expression mit zellulären Aktivierungskinetiken korrelieren, wurde noch nicht im Detail und auf Populationsebene untersucht. Dieser Umstand beruht vor allem auf fehlenden Untersuchungsmethoden, welche erlauben zelluläre Funktionen und endogene (TRPV1-) Proteinexpression in einzelnen Zelle zu untersuchen. Mit konfokalen und “High Content Screening”- Mikroskopieverfahren quantifizierte ich die Heterogenität der TRPV1 Expression in nozizeptiven Neuronen. Antikörper basierte Expressionsanalysen als auch Calcium Imaging identifizierten 60.4 ± 6.5 % (Immunzytochemie) und 58.2 ± 6.8 % (Capsaicin sensitive Neurone) der sensorischen Neurone als TRPV1 exprimierend. Eine detaillierte Analyse der Calcium Imaging Experimente zeigte, dass submaximale Capsaicin-Konzentrationen nicht in niedrigeren Calcium Antworten resultieren sondern weniger Capsaicin sensitive Zellen zeigten. Weiterhin wurde eine klare Korrelation zwischen exogener TRPV1 Expression und der Capsaicin induzierten Calcium Einstromamplitude in TRPV1 transfizierten Zelllinien detektiert, welche in endogen expremierenden nozizeptiven Neuronen fast nicht vorhanden war. Vorbehandlungen mit starken sensitivierungs-induzierenden Substanzen (PMA und FSK) zeigten eine Verbesserung, konnten jedoch nicht die Heterogenität zwischen Expression und Antwort erklären. Dementsprechend korrelierte ein Sensitivierungs-Signalwirkungsprotein, die regulatorische Untereinheit von PKA RIIβ, besser mit der zellulären Capsaicin-Antwort als TRPV1. Da eine starke Sensitivierung nicht zu einer vollständigen Korrelation, zwischen Expression und Capsaicin induziertem Calcium Einstrom führten, müssen andere Regulationsmechanismen existieren wie beispielweise die Expression von Modulatoren. Um neue TRPV1-Modulatoren zu identifizieren und genetische Einblicke in Nozizeptoren zu erlangen, entwickelten wir subgruppen-spezifische Transkriptom-Analyseverfahren. Eine daraus resultierende Liste von hoch regulierten Genen eröffnet die Möglichkeit, neue TRPV1 und damit Schmerzmodulatoren zu identifizieren. Die Liste präsentiert weiterhin, das erste vollständige Transkriptom einer Subpopulation nozizeptiver sensorischer Neurone. In Kollaboration mit Steffen Waldherr verwendete ich meine Ergebnisse um ein computergestütztes Modell für die zelluläre Capsaicin-Sensitivität zu entwickeln. In diesem, auf experimentellen Daten und Literatur basierten Modell, wird ein Mechanismus angedeutet, welcher die relative zelluläre Capsaicin Sensitivität invers zur TRPV1-Epression in sensorischen Neuronen reguliert. Daher ist die Capsaicin-Antwort überraschend robust gegenüber Veränderungen in der TRPV1-Expression. Wenn die TRPV1 vermittelte Calciumeinströme so unempfindlich gegenüber Veränderungen der TRPV1-Expression sind, hinterfragen meine Ergebnisse das konventionelle therapeutische Konzept von TRPV1-Kanalblockern. Sie zeigen den Bedarf auf, zelluläre Mechanismen zu definieren, welche die TRPV1 vermittelte Calcium-Einstrom-Homöostase kontrollieren.
