dc.contributor.author
Buschow, René
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:56:05Z
dc.date.available
2015-09-18T08:56:47.046Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9822
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14020
dc.description.abstract
The question on the number of human senses in western societies is typically
answered with five. Asking people anywhere in the world, what is most annoying
feeling, the majority will answer emotional, physical, or diseases related
pain. Whatever reason, the answer is mostly pain. But can the perception of
pain be defined as sense? The answer is yes. Pain initiating stimuli activate
specialized peripheral sensory neurons from the dorsal root ganglia - the so
called nociceptive neurons. One protein central for inflammatory temperature
pain is the ion channel TRPV1. TRPV1 protein expression in sensory neurons is
upregulated in situations of hightened pain sensitivity, suggesting a direct
causal relationship between the TRPV1 expression levels and pain sensitivity.
A number of processes have been identified describing the sensitization and
desensitization of TRPV1 on a molecular level. But, to what extend the
expression levels of TRPV1 correlates with its cellular activation kinetics on
a population base has not been analyzed in detail so far. This is due to, a
lack of suitable technical approaches to analyze the function and (TRPV1-)
protein expression levels on a single cell base. I quantified the
heterogeneity of TRPV1 expression in nociceptive neurons, with confocal and
“high content screening” microscopy approaches. Antibody based expression
analysis and calcium imaging identified 60.4 ± 6.5 % (immune cytochemistry)
and 58.2 ± 6.8 % (capsaicin responsive cells) sensory neurons, to be TRPV1
expressing. In depth analysis of the calcium imaging experiments revealed,
that submaximal capsaicin concentrations do not result in lower responses but
lower numbers of capsaicin sensitive cells. Further, a correlation between
TRPV1 expression and the amplitude of capsaicin induced calcium influx was
clearly detectable in exogenously expressed TRPV1 transfected cell lines, but
was almost absent in endogenously expressing nociceptive neurons. Pretreatment
with strong sensitization inducing substances (PMA and FSK) resulted in an
improvement of the correlation – nevertheless, still not explaining all the
heterogeneity between expression and response. Accordingly, a sensitization
signaling protein, the regulatory subunit of PKA RIIβ, correlated better with
the cellular capsaicin response than TRPV1 itself. As the strong sensitization
signaling did not result in a complete correlation between expression and
capsaicin induced calcium influx, there must exist other mechanisms of
regulation such as expression of modulators. To identify novel TRPV1 modulator
and gain genetic insights into nociceptors, we developed a novel subgroup
specific transcriptome analysis approach. The resulting list of up regulated
genes offers the opportunity to identify novel TRPV1 and pain modulators.
Furthermore, the list presents the first complete transcriptome of a
subpopulation of nociceptive neurons. In collaboration with Steffen Waldherr,
my results were analyzed by establishing a computational model for the
cellular capsaicin sensitivity. From this model based on experimental data and
literature derived values, a mechanism is suggested, which regulates the
relative capsaicin sensitivity state inversely to the TRPV1 expression in
sensory neurons. Thus, the TRPV1 response is surprisingly robust against
changes in TRPV1 expression levels. My results question the conventional
therapeutic use of TRPV1-channel blockers and suggest the need to define the
cellular mechanisms how the TRPV1-mediated calcium influx-homeostasis is
controlled.
de
dc.description.abstract
Die Frage nach der Anzahl menschlicher Sinne wird in westlichen Gesellschaften
typischerweise mit fünf beantwortet. Fragt man Menschen irgendwo auf der Welt
nach ihrem unangenehmsten Gefühl, wird die Mehrzahl entweder mit emotionalen,
physischen oder krankheitsbedingten Schmerz antworten. Auf welcher Ursache
auch immer die resultierende Antwort basiert, sie ist in den meisten Fällen
Schmerz. Aber kann die Wahrnehmung von Schmerz als Sinn definiert werden? Die
Antwort ist ja. Schmerz verursachende Stimuli aktivieren spezialisierte
sensorische Neurone aus den dorsalen Hinterwurzel Ganglien, die sogenannten
Nozizeptoren. Ein zentrales Protein für entzündlichen Temperaturschmerz ist
der Ionenkanal TRPV1. Unter Bedingungen erhöhter Schmerzsensitivität ist die
TRPV1 Proteinexpression in nozizeptiven Neuronen erhöht. Dies deutet auf eine
direkte kausale Beziehung zwischen TRPV1 Expressionsmengen und
Schmerzsensitivität hin. Eine Reihe von Prozessen wurde bereits identifiziert,
welche die Sensitivierung und Desensitiverung von TRPV1 auf molekularer Ebene
beschreiben. In welchem Ausmaß jedoch die TRPV1 Expression mit zellulären
Aktivierungskinetiken korrelieren, wurde noch nicht im Detail und auf
Populationsebene untersucht. Dieser Umstand beruht vor allem auf fehlenden
Untersuchungsmethoden, welche erlauben zelluläre Funktionen und endogene
(TRPV1-) Proteinexpression in einzelnen Zelle zu untersuchen. Mit konfokalen
und “High Content Screening”- Mikroskopieverfahren quantifizierte ich die
Heterogenität der TRPV1 Expression in nozizeptiven Neuronen. Antikörper
basierte Expressionsanalysen als auch Calcium Imaging identifizierten 60.4 ±
6.5 % (Immunzytochemie) und 58.2 ± 6.8 % (Capsaicin sensitive Neurone) der
sensorischen Neurone als TRPV1 exprimierend. Eine detaillierte Analyse der
Calcium Imaging Experimente zeigte, dass submaximale Capsaicin-Konzentrationen
nicht in niedrigeren Calcium Antworten resultieren sondern weniger Capsaicin
sensitive Zellen zeigten. Weiterhin wurde eine klare Korrelation zwischen
exogener TRPV1 Expression und der Capsaicin induzierten Calcium
Einstromamplitude in TRPV1 transfizierten Zelllinien detektiert, welche in
endogen expremierenden nozizeptiven Neuronen fast nicht vorhanden war.
Vorbehandlungen mit starken sensitivierungs-induzierenden Substanzen (PMA und
FSK) zeigten eine Verbesserung, konnten jedoch nicht die Heterogenität
zwischen Expression und Antwort erklären. Dementsprechend korrelierte ein
Sensitivierungs-Signalwirkungsprotein, die regulatorische Untereinheit von PKA
RIIβ, besser mit der zellulären Capsaicin-Antwort als TRPV1. Da eine starke
Sensitivierung nicht zu einer vollständigen Korrelation, zwischen Expression
und Capsaicin induziertem Calcium Einstrom führten, müssen andere
Regulationsmechanismen existieren wie beispielweise die Expression von
Modulatoren. Um neue TRPV1-Modulatoren zu identifizieren und genetische
Einblicke in Nozizeptoren zu erlangen, entwickelten wir subgruppen-spezifische
Transkriptom-Analyseverfahren. Eine daraus resultierende Liste von hoch
regulierten Genen eröffnet die Möglichkeit, neue TRPV1 und damit
Schmerzmodulatoren zu identifizieren. Die Liste präsentiert weiterhin, das
erste vollständige Transkriptom einer Subpopulation nozizeptiver sensorischer
Neurone. In Kollaboration mit Steffen Waldherr verwendete ich meine Ergebnisse
um ein computergestütztes Modell für die zelluläre Capsaicin-Sensitivität zu
entwickeln. In diesem, auf experimentellen Daten und Literatur basierten
Modell, wird ein Mechanismus angedeutet, welcher die relative zelluläre
Capsaicin Sensitivität invers zur TRPV1-Epression in sensorischen Neuronen
reguliert. Daher ist die Capsaicin-Antwort überraschend robust gegenüber
Veränderungen in der TRPV1-Expression. Wenn die TRPV1 vermittelte
Calciumeinströme so unempfindlich gegenüber Veränderungen der TRPV1-Expression
sind, hinterfragen meine Ergebnisse das konventionelle therapeutische Konzept
von TRPV1-Kanalblockern. Sie zeigen den Bedarf auf, zelluläre Mechanismen zu
definieren, welche die TRPV1 vermittelte Calcium-Einstrom-Homöostase
kontrollieren.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
high content screening
dc.subject
sensory neurons
dc.subject
calcium imaging
dc.subject
quantitative microscopy
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
The heterogeneity of TRPV1 and its activation in nociceptive neurons
dc.contributor.contact
RBuschow@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Tim Hucho
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Petra Knaus
dc.date.accepted
2015-09-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100196-5
dc.title.translated
Die Heterogenität von TRPV1 und seine Aktivierung in nozizeptiven Neuronen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100196
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000017758
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access