Protease stability is a pivotal consideration in the development of peptide- based drugs. Improving the bioavailability of pharmacologically active peptides requires in-depth investigation into the noncovalent interactions between the protease and the peptide substrate under consideration. To this end, different strategies such as the use of unnatural building blocks and fluorinated amino acids have become standard approaches in protein engineering. The incorporation of fluorine into amino acids has attracted much interest in recent years due to the unique stereoelectronic properties of fluorine, which have already proven useful in the development of therapeutically active small molecules. In this manner, the current thesis presents data on the systematic investigation of the influence of side chain fluorination on proteolytic stability of peptide sequences that are based on ideal protease substrates. Several model peptides were designed according to the specificities of serine and aspartic proteases; three different control sequences were modified by introducing either 2-aminobutyric acid (Abu) or one of its fluorinated derivatives at the P2, P1'or P2' positions. Through the use of an RP-HPLC assay with fluorescence detection, the proteolytic stabilities of these peptides toward α-chymotrypsin, pepsin, elastase, proteinase K and human blood plasma proteases were determined. Molecular modeling was used to support the interpretation of the structure-activity relationship based on the analysis of potential ligand-enzyme interactions. In all cases, increases and decreases in proteolytic stability were observed for the different isolated enzymes and the human blood plasma, and these effects depend upon the particular peptide sequence, the fluorine content of the side chain, and the position of substitution relative to the cleavage site. Interestingly, in some cases fluorination leads to dramatic improvements in resistance to degradation: namely, TfeGly and DfeGly at the P2’ position with pepsin; DfeGly at the P2 position with chymotrypsin; TfeGly and DfeGly at the P2 and P2’ positions with proteinase K; and TfeGly at the P2 and P1’ positions with elastase. Our observations indicate that although the fluorination of peptide substrates does not always have predictable effects on proteolytic stability, this strategy for developing more bioavailable peptide therapies is promising; in particular, part of this thesis was devoted to establishing an analytical approach for the identification of fluorinated peptide-based HIV-1 entry inhibitors.
Die Proteasestabilität ist ein wichtiges Kriterium bei der Erntwicklung von Peptid-basierten Medikamenten. Daher umfasst die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von pharmakologisch aktiven Peptiden eine gründliche Untersuchung der nichtkovalenten Interaktionen zwischen Protease und Peptidsubstrat. In diesem Zusammenhang gehören verschiedene Strategien, wie beispielsweise die Verwendung von nicht-natürlichen Aminosäuren mittlerweile zu etablierten Methoden im Protein Engineering. Der Einbau fluorierte Aminosäuren hat in den letzten Jahren besonders an Bedeutung gewonnen, da das Element Fluor über einzigartige stereoelektroische Eigenschaften verfügt, die sich bei der Entwicklung von Pharmazeutikern als nützlich erwiesen haben. Die vorliegende Arbeit beschreibt die systematische Untersuchung des Einflusses von unterschiedlichen Fluormodifikationen auf die Proteasestabilität von Modelpeptiden, deren Sequenzen auf idealen Proteasesubstraten basieren. Die untersuchten Modelpeptide wurden dabei so entwickelt, dass sie für Serin- und Aspatatproteasen spezifisch sind. Die Peptide wurden so modifiziert, dass sie entweder α-Aminobuttersäure (Abu) oder dessen fluorierte Derivate in den Positionen P2, P1’ oder P2’ enthielten. Mit Hilfe eines RP-HPLC basierten Assays, welcher eine Fluoreszenzdetektion der Spaltprodukte nutzte, wurde die proteolytische Stabilität der jeweiligen Peptide gegenüber den isolierten Proteasen α-Chymotrypsin, Pepsin, Elastase, Proteinase K sowie in Anwesenheit von menschlichem Blutplasma ermittelt. Die Interpretation der Struktur- Wirkungsbeziehung wurde zusätzlich durch Molecular Modeling Simulationen unterstützt, welche auf den spezifischen Ligand-Enzym Wechselwirkunugen basierten. In allen untersuchten Fällen wurden sowohl höhere als auch geringere Proteasestabiltäten für die isolierten Enzyme sowie für das humane Blutplasma gefunden. Diese Effekte ergaben sich in Abhängigkeit von der Peptidsequenz, vom eingesetzten Enzym, von der jeweils substituierten Position relativ zur Schnittstelle des Enzyms und den jeweilig eingebauten fluorierten Aminosäuren, die einen unterschiedlichen Fluorgehalt in der Seitenkette aufweisen. Interessanterweise führt der Einbau fluorierte Aminosäuren in die Peptidsequenzen in einigen Fällen zu einer deutlich gesteigerten Proteasestabilität. Diese Effekt wurde in folgenden Fällen beobachtet: a) für den Einbau von TfeGly und DfeGly in P2’ Position des Substrats mit Pepsin als Enzym; b) für DfeGly in P2 Position gegenüber α-Chymotrypsin; c) für TfeGly und DfeGly in den Positionen P2 und P2’ in Anwesenheit von Proteinase K; und d) für TfeGly eingebaut in P2 und P1’ Position mit dem Enzym Elastase. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Fluormodifikationen einen unvorhersehbaren Effekt auf die proteolytische Stabilität von Peptiden haben können und somit eine viel versprechende Strategie für die Entwicklung von Peptidbasierten Therapeutikern sein können. Unter dieser Berücksichtigung wurde ein Teil dieser Arbeit der Etablierung eines analytischen Ansatzes für die Identifikation von fluorierten Peptiden gewidmet, welche als potentielle HIV1-Eintritts Inhibitoren Anwendung finden könnten.
