dc.contributor.author
Asante, Vivian
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:51:35Z
dc.date.available
2015-03-02T12:16:50.614Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9736
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13934
dc.description.abstract
Protease stability is a pivotal consideration in the development of peptide-
based drugs. Improving the bioavailability of pharmacologically active
peptides requires in-depth investigation into the noncovalent interactions
between the protease and the peptide substrate under consideration. To this
end, different strategies such as the use of unnatural building blocks and
fluorinated amino acids have become standard approaches in protein
engineering. The incorporation of fluorine into amino acids has attracted much
interest in recent years due to the unique stereoelectronic properties of
fluorine, which have already proven useful in the development of
therapeutically active small molecules. In this manner, the current thesis
presents data on the systematic investigation of the influence of side chain
fluorination on proteolytic stability of peptide sequences that are based on
ideal protease substrates. Several model peptides were designed according to
the specificities of serine and aspartic proteases; three different control
sequences were modified by introducing either 2-aminobutyric acid (Abu) or one
of its fluorinated derivatives at the P2, P1'or P2' positions. Through the use
of an RP-HPLC assay with fluorescence detection, the proteolytic stabilities
of these peptides toward α-chymotrypsin, pepsin, elastase, proteinase K and
human blood plasma proteases were determined. Molecular modeling was used to
support the interpretation of the structure-activity relationship based on the
analysis of potential ligand-enzyme interactions. In all cases, increases and
decreases in proteolytic stability were observed for the different isolated
enzymes and the human blood plasma, and these effects depend upon the
particular peptide sequence, the fluorine content of the side chain, and the
position of substitution relative to the cleavage site. Interestingly, in some
cases fluorination leads to dramatic improvements in resistance to
degradation: namely, TfeGly and DfeGly at the P2’ position with pepsin; DfeGly
at the P2 position with chymotrypsin; TfeGly and DfeGly at the P2 and P2’
positions with proteinase K; and TfeGly at the P2 and P1’ positions with
elastase. Our observations indicate that although the fluorination of peptide
substrates does not always have predictable effects on proteolytic stability,
this strategy for developing more bioavailable peptide therapies is promising;
in particular, part of this thesis was devoted to establishing an analytical
approach for the identification of fluorinated peptide-based HIV-1 entry
inhibitors.
de
dc.description.abstract
Die Proteasestabilität ist ein wichtiges Kriterium bei der Erntwicklung von
Peptid-basierten Medikamenten. Daher umfasst die Verbesserung der
Bioverfügbarkeit von pharmakologisch aktiven Peptiden eine gründliche
Untersuchung der nichtkovalenten Interaktionen zwischen Protease und
Peptidsubstrat. In diesem Zusammenhang gehören verschiedene Strategien, wie
beispielsweise die Verwendung von nicht-natürlichen Aminosäuren mittlerweile
zu etablierten Methoden im Protein Engineering. Der Einbau fluorierte
Aminosäuren hat in den letzten Jahren besonders an Bedeutung gewonnen, da das
Element Fluor über einzigartige stereoelektroische Eigenschaften verfügt, die
sich bei der Entwicklung von Pharmazeutikern als nützlich erwiesen haben. Die
vorliegende Arbeit beschreibt die systematische Untersuchung des Einflusses
von unterschiedlichen Fluormodifikationen auf die Proteasestabilität von
Modelpeptiden, deren Sequenzen auf idealen Proteasesubstraten basieren. Die
untersuchten Modelpeptide wurden dabei so entwickelt, dass sie für Serin- und
Aspatatproteasen spezifisch sind. Die Peptide wurden so modifiziert, dass sie
entweder α-Aminobuttersäure (Abu) oder dessen fluorierte Derivate in den
Positionen P2, P1’ oder P2’ enthielten. Mit Hilfe eines RP-HPLC basierten
Assays, welcher eine Fluoreszenzdetektion der Spaltprodukte nutzte, wurde die
proteolytische Stabilität der jeweiligen Peptide gegenüber den isolierten
Proteasen α-Chymotrypsin, Pepsin, Elastase, Proteinase K sowie in Anwesenheit
von menschlichem Blutplasma ermittelt. Die Interpretation der Struktur-
Wirkungsbeziehung wurde zusätzlich durch Molecular Modeling Simulationen
unterstützt, welche auf den spezifischen Ligand-Enzym Wechselwirkunugen
basierten. In allen untersuchten Fällen wurden sowohl höhere als auch
geringere Proteasestabiltäten für die isolierten Enzyme sowie für das humane
Blutplasma gefunden. Diese Effekte ergaben sich in Abhängigkeit von der
Peptidsequenz, vom eingesetzten Enzym, von der jeweils substituierten Position
relativ zur Schnittstelle des Enzyms und den jeweilig eingebauten fluorierten
Aminosäuren, die einen unterschiedlichen Fluorgehalt in der Seitenkette
aufweisen. Interessanterweise führt der Einbau fluorierte Aminosäuren in die
Peptidsequenzen in einigen Fällen zu einer deutlich gesteigerten
Proteasestabilität. Diese Effekt wurde in folgenden Fällen beobachtet: a) für
den Einbau von TfeGly und DfeGly in P2’ Position des Substrats mit Pepsin als
Enzym; b) für DfeGly in P2 Position gegenüber α-Chymotrypsin; c) für TfeGly
und DfeGly in den Positionen P2 und P2’ in Anwesenheit von Proteinase K; und
d) für TfeGly eingebaut in P2 und P1’ Position mit dem Enzym Elastase. Unsere
Ergebnisse zeigen, dass Fluormodifikationen einen unvorhersehbaren Effekt auf
die proteolytische Stabilität von Peptiden haben können und somit eine viel
versprechende Strategie für die Entwicklung von Peptidbasierten Therapeutikern
sein können. Unter dieser Berücksichtigung wurde ein Teil dieser Arbeit der
Etablierung eines analytischen Ansatzes für die Identifikation von fluorierten
Peptiden gewidmet, welche als potentielle HIV1-Eintritts Inhibitoren Anwendung
finden könnten.
de
dc.format.extent
XII, 148 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Aminobutyric acid
dc.subject
Difluoroethylglycine
dc.subject
Trifluoroethylglycine
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::547 Organische Chemie
dc.title
Impact of amino acid side chain fluorination on proteolytic stability of
peptides
dc.contributor.contact
vansante2002@yahoo.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Beate Koksch
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rainer Haag
dc.date.accepted
2015-02-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098774-8
dc.title.translated
Der Einfluss von Seitenketten-Fluorierung auf die proteolytische Stabilität
von Peptiden
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000098774
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000016626
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access