Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a rare, genetically heterogeneous disease characterized by a reduced head circumference at birth and intellectual deficit. Biallelic mutations in the Cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit-associated protein 2 gene CDK5RAP2 cause MCPH type 3 (MCPH3). CDK5RAP2 function contributes to cellular processes such as centrosome function, cell cycle checkpoint control, DNA repair, chromosome condensation, and kinetochore attachment to spindles. One current model for the microcephaly phenotype in MCPH3 invokes a premature shift from symmetric to asymmetric cell divisions and thus premature neurogenesis with a subsequent depletion of the progenitor pool. In addition, other mechanisms may also play a role. The aim of my PhD thesis work was to better understand the role of CDK5RAP2 in physiological brain development and in disease. Specific aims were (i) to characterize the spatiotemporal CDK5RAP2 expression during normal murine and human brain development, (ii) to characterize the phenotype of a Cdk5rap2 mutant mouse generated in our research group, and (iii) to identify further MCPH3 patients with novel CDK5RAP2 mutations and thereby better characterize the phenotype spectrum of MCPH3. We found that in the murine brain Cdk5rap2 expression boosts during early embryonic stages, when proliferation rates are high and neocortical development is initiated. In human and murine brain, CDK5RAP2 is present in brain structures with high proliferative rates and, colocalizes with progenitor cells, glial cells, and early neurons. As the brain matures, CDK5RAP2 is refined to specific substructures within regions, which correspond to preserved proliferation zones. Moreover, we found concordance between regions of high CDK5RAP2 expression in the mouse and sites of pathology suggested by neuroimaging studies in humans and mouse. Our findings in human and mouse tissue confirm the function of CDK5RAP2 in cell proliferation. In addition, we described for the first time in detail the clinical, radiological, and also the cellular phenotype of MCPH3 patients with a novel homozygous nonsense mutation in the CDK5RAP2 gene. Cells from the patients showed mitotic spindle defects and disrupted γ-tubulin localization to the centrosome, which underlines the importance of CDK5RAP2 in mitotic spindle pole organization and centrosome integrity. These findings suggest that MCPH3 pathomechanism is partially due to mitotic spindle and centrosomal defects. To further mimic the human mutation and study the function of CDK5RAP2 in vivo, we generated a transgenic Cdk5rap2 mouse. These mice did not display the expected microcephaly phenotype. Our further analysis indicated that a previously unknown splice variant of the Cdk5rap2 gene exists, which allows translation of Cdk5rap2, even in the mutant mice. With our studies, we provide for the first time a systematic description of the spatiotemporal expression of CDK5RAP2 in murine and human developing brain. Moreover, the cellular phenotype findings we collected from the new MCPH3 patients provide a glimpse into processes that could lead to the microcephaly phenotype in MCPH.
Die Autosomal-rezessive primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine seltene und genetisch heterogene Erkrankung, die sich durch einen kongenital reduzierten Kopfumfang und eine mentale Retardierung auszeichnet. Biallelische Mutationen im Cyclin-dependent-kinase-5-regulatory-subunit-associated-Protein 2 Gen CDK5RAP2 verursachen die MCPH vom Typ 3 (MCPH3). Das CDK5RAP2 spielt eine Rolle in zellulären Prozessen wie der Funktion von Zentrosomen, der Kontrolle der Zellzyklus-Checkpoints, DNA-Reparatur, Chromosomenkondensation und Kinetochor Befestigung an Spindeln. Eine der Haupthypothesen für die Entstehung des Mikrozephalie-Phänotyps bei MCPH3 beinhaltet einen vorzeitigen Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Zellteilungen und damit eine vorzeitige Neurogenese sowie eine Depletion des Vorläuferpools. Darüber hinaus können auch andere Mechanismen eine Rolle spielen. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Rolle des CDK5RAP2-Proteins in der physiologischen Entwicklung des Gehirns und in der Entstehung von MCPH besser zu verstehen. Spezifische Ziele waren (i) die zeitliche und örtliche Expression von CDK5RAP2 während der normalen Entwicklung des Gehirns von Menschen und Mäusen zu veranschaulichen, (ii) den Phänotyp einer in unserer Forschungsgruppe erzeugten Cdk5rap2-Mausmutanten zu charakterisieren, und (iii) weitere MCPH3 Patienten mit bisher nicht beschriebenen Mutationen im CDK5RAP2-Gen zu identifizieren und damit das Phänotypspektrum der MCPH3 besser zu erforschen. Wir fanden, dass Cdk5rap2 während der frühen embryonalen Stadien im murinen Gehirn besonders hoch exprimiert wird, d.h. während einer Zeit in der hohe Proliferationsraten auftreten und die Neokortex-Entwicklung bei Mensch und Maus beginnt. In humanen und murinen Gehirnen, ist CDK5RAP2 in Hirnstrukturen mit hoher Proliferationsrate vorhanden und kolokalisiert mit Vorläuferzellen, Gliazellen und unreifen Neuronen. Mit der Entwicklung des Gehirns reduziert sich das Vorhandensein von CDK5RAP2 auf spezifische Unterstrukturen, in denen die Proliferation anhält. Darüber hinaus fanden wir Übereinstimmungen zwischen Regionen mit hoher CDK5RAP2 Expression in der Maus und der durch bildgebene Verfahren beschriebenen Pathologie bei Mensch und Maus. Unsere Ergebnisse in Human- und Mausgewebe bestätigen die Rolle von CDK5RAP2 in der Zellproliferation. Zusätzlich beschrieben wir zum ersten Mal detailliert den klinischen, radiologischen und auch den zellulären Phänotyp von Patienten mit MCPH3 mit einer bisher nicht beschriebenen homozygoten Nonsense-Mutation im CDK5RAP2-Gen. Wir fanden, dass Zellen von Patienten eine abnorme Morphe ihrer mitotischen Spindelapparate sowie eine gestörte Lokalisation des γ-Tubulins am Zentrosom aufwiesen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von CDK5RAP2 in der Organisation der mitotischen Spindel und der Zentrosomintegrität. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der MCPH3-Pathomechanismus teilweise auf Defekte der mitotischen Spindel und der Zentrosomen zurückzuführen ist. Um die Auswirkungen einer CDK5RAP2-Mutation im Menschen weiter zu imitieren und die Funktion des CDK5RAP2-Proteins in vivo zu untersuchen, generierten wir eine transgene Cdk5rap2-Mausmutante. Diese Mäuse bildeten aber nicht den erwarteten Mikrozephalie-Phänotyp aus. Weitere Analysen zeigten, dass es eine bisher unbekannte Spleißvariante des Cdk5rap2-Gens gibt, die selbst in den Mausmutanten die Translation von Cdk5rap2 ermöglicht. Diesen Studien bieten zum ersten Mal eine systematische Beschreibung der CDK5RAP2-Expression während der Entwicklung muriner und humaner Gehirne. Darüber hinaus geben unsere am Patienten erhobenen Ergebnisse des zellulären Phänotyps einen Einblick in Prozesse, die zum Mikrozephalie- Phänotyp bei MCPH führen könnten.
