The accurate position of the nucleus within a cell is important for many biological processes such as cell migration or differentiation and relies on the connections between the nuclear envelope (NE) and the cytoskeleton. Nuclear positioning is particularly controlled during skeletal muscle formation, when post-mitotic myoblasts fuse to form multinucleated myotubes and when myotubes further differentiate into mature myofibers. Defects in nuclear positioning were shown to affect muscle function and are linked to many muscle diseases, such as Centronuclear Myopathies (CNM) and Emery- Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD). Nuclear movement during myogenic differentiation is highly dependent on microtubules (MTs) which adopt a unique organization during the muscle differentiation process. In comparison to proliferating myoblasts, where MTs are radially nucleated from the centrosome, MTs are nucleated from the NE in dense bundles parallel to the cell axis in differentiated myotubes. This dramatic reorganization of the MT network during muscle development is accompanied by a redistribution of the Golgi complex and proteins from the centrosome (e.g. Pericentrin, Pcm1, Akap450) to the NE. Thus, the nucleus takes over the function as a non-centrosomal microtubule- organizing center (MTOC) during myogenic differentiation. However, the molecular mechanisms underlying centrosomal protein recruitment and anchoring to the NE as well as their capacity to organize MTs are still unknown. Here, we performed a siRNA screen against 299 genes encoding NE-transmembrane or NE- associated proteins and identified Nesprin-1, a KASH (Klarsicht/ANC-1/SYNE homology) domain protein located at the outer nuclear membrane (ONM), involved in the recruitment of Pericentrin to the NE during myogenic differentiation. In C2C12 myotubes depleted for Nesprin-1 or in myotubes from a congenital muscular dystrophy patient carrying a nonsense mutation within the Nesprin-1/SYNE1 (23560 G>T) gene, several centrosomal proteins, including Pericentrin, Akap450, Pcm1, and Cdk5Rap2, are mislocalized in the cytoplasm in close proximity to mislocalized Golgi fragments. During skeletal muscle formation, a muscle-specific isoform of Nesprin-1, namely Nesprin-1alpha, is increasingly expressed. Using the proximity-dependent biotin identification method, BioID, we could show that Nesprin-1alpha is highly associated with Akap450, Pericentrin and Pcm1 in C2C12 myotubes. Moreover, re-expression of Nesprin-1alpha in Nesprin-1-depleted cells is sufficient to rescue the observed recruitment defects, thus confirming Nesprin-1alpha as the major receptor at the NE to anchor centrosomal proteins. However, Nesprin-1alpha together with Sun1/Sun2 are not only important for recruiting centrosomal proteins but also for MTOC activity. MTs are nucleated from the NE in differentiated muscle cells, whereas MTs grow from cytoplasmic foci containing mislocalized Golgi fragments and centrosomal proteins in Nesprin-1- or Sun1/Sun2-depleted cells. Among the recruited centrosomal proteins, solely Akap450 seems to be required for MT nucleation from the NE. Using computer simulations and knockdown experiments, we demonstrate that Akap450-Nesprin- 1alpha-mediated MT nucleation from the nucleus has a biological relevance for nuclear positioning during myotube formation. Taken together, our data suggest a model where Nesprin-1alpha, when upregulated during myogenic differentiation, forms a complex with Sun1/Sun2 and thereby anchors centrosomal proteins at the nucleus. In turn, Akap450 plays a key role in inducing MT nucleation, thereby assuring proper nuclear positioning during skeletal muscle formation. These findings strengthen our understanding on how non-centrosomal MTOCs form in muscle and how defects within the underlying mechanism can potentially contribute to nuclear positioning defects in muscular dystrophies.
Die korrekte Position des Zellkerns ist für viele biologische Prozesse, z.B. während der Zellmigration oder der Differenzierung, wichtig und erfordert Verbindungen zwischen der Kernmembran und dem Zytoskelett. Die Positionierung des Zellkerns ist vor allem während der Bildung des Skelettmuskels streng kontrolliert, wenn postmitotische Myoblasten miteinander fusionieren, um multinukleäre Myotuben zu bilden, und wenn Myotuben weiter in reife Muskelfasern differenzieren. Fehlpositionierte Zellkerne stehen im Verdacht, die Muskelfunktion zu beeinträchtigen und hängen somit oft mit verschiedenen Muskelerkrankungen, wie z.B. der zentronukleären Myopathie und der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie, zusammen. Die Bewegung von Zellkernen ist während der myogenen Differenzierung von Mikrotubuli abhängig, die während des Differenzierungsprozesses umfangreich umorganisiert werden. Während Mikrotubuli in proliferierenden Myoblasten radial vom Zentrosom nukleiert werden, werden sie in differenzierten Myotuben von der Kernmembran in dichten, parallel zur Zellachse verlaufenden, Bündeln nukleiert. Diese drastische Umstrukturierung des Mikrotubuli-Netzwerkes geht während der Muskelentwicklung mit einer Umordnung des Golgi-Komplexes und von zentrosomalen Proteinen (z.B. Pericentrin, Pcm1, Akap450) zur Kernmembran einher. Der Zellkern übernimmt somit während der myogenen Differenzierung die Funktion eines nicht- zentrosomalen Mikrotubulus-Organisationszentrums. Der molekulare Mechanismus, wie zentrosomale Proteine rekrutiert und an der Kernmembran verankert werden, und wie Zellkerne die Fähigkeit erlangen Mikrotubuli zu organisieren, ist jedoch bisher ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit haben wir mit Hilfe einer funktionalen siRNA-Analyse 299 verschiedene Gene untersucht, die transmembranäre Kernmembranproteine oder Kernmembran-assoziierte Proteine kodieren. Dabei haben wir Nesprin-1, ein KASH-(Klarsicht/ANC-1/SYNE Homologie) Domänen-Protein der äußeren Kernmembran, als potenziellen Rezeptor für die Rekrutierung von Pericentrin zur Kernmembran während der myogenen Differenzierung identifiziert. In Nesprin-1-defizienten C2C12 Myotuben sowie in Myotuben von einem Patienten mit kongenitaler Muskeldystrophie (Mutation innerhalb des Nesprin-1/SYNE1 (23560 G>T) Gens), waren einige zentrosomale Proteine, Pericentrin, Akap450, Pcm1 und Cdk5Rap2, im Zytoplasma in der Nähe von mislokalisierten Golgi-Fragmenten fehllokalisiert. Während der Bildung des Skelettmuskels, wird Nesprin-1alpha, eine muskelspezifische Isoform von Nesprin-1, verstärkt exprimiert. Mit Hilfe der BioID-Methode konnte gezeigt werden, dass Nesprin-1alpha stark mit Akap450, Pericentrin und Pcm1 in C2C12 Myotuben assoziiert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Reexprimierung von Nesprin-1alpha in Nesprin-1-defizienten Zellen ausreichend ist, um die beobachteten Rekrutierungsdefekte zentrosomaler Proteine zu beheben. Nesprin-1alpha konnte somit als wesentlicher Rezeptor für die Verankerung zentrosomaler Proteine an der Kernmembran bestätigt werden. Nesprin-1alpha wurde jedoch im Zusammenhang mit Sun1/Sun2 nicht nur für die Rekrutierung zentrosomaler Proteine als wichtig erwiesen, sondern auch für die Aktivität des Mikrotubulus-Organisationszentrums. Während Mikrotubuli in differenzierten Zellen von der Kernmembran nukleiert wurden, wurden sie in Nesprin-1- oder Sun1/Sun2-defizienten Zellen von zytoplasmatischen Stellen, die mislokalisierte Golgi-Fragmente und zentrosomale Proteine enthielten, gebildet. Von den zentrosomalen Proteinen, die bekannt sind, während der myogenen Differenzierung zur Kernmembran zu lokalisieren, war lediglich Akap450 benötigt, um die Mikrotubuli-Nukleation an der Kernmembran zu induzieren. Mit Hilfe von Computersimulationen und Knockdown-Experimenten konnten wir zeigen, dass die durch Akap450 und Nesprin-1 vermittelte Mikrotubuli-Nukleation von der Kernmembran eine wichtige Rolle bei der Positionierung der Zellkerne innerhalb von Myotuben spielt. Zusammengefasst können wir anhand unserer Daten ein Modell vorschlagen, in dem Nesprin-1alpha, wenn es während der myogenen Differenzierung hochreguliert wird, einen Komplex mit Sun1/Sun2 bildet und dabei zentrosomale Proteine am Zellkern verankert. Anschließend induziert Akap450 die Nukleation von Mikrotubuli an der Kernmembran und gewährleistet somit die korrekte Positionierung von Zellkernen während der Bildung des Skelettmuskels. Insgesamt verstärken unsere Ergebnisse unser allgemeines Verständnis, wie nicht-zentrosomale Mikrotubulus- Organisationszentren im Muskel gebildet werden und wie Defekte in den zugrundeliegenden Mechanismen zu potenziellen Fehlern bei der Zellkernpositionierung in Muskeldystrophien beitragen können.
