dc.contributor.author
Gimpel, Petra
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:28:30Z
dc.date.available
2017-10-06T09:58:57.157Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9307
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13506
dc.description.abstract
The accurate position of the nucleus within a cell is important for many
biological processes such as cell migration or differentiation and relies on
the connections between the nuclear envelope (NE) and the cytoskeleton.
Nuclear positioning is particularly controlled during skeletal muscle
formation, when post-mitotic myoblasts fuse to form multinucleated myotubes
and when myotubes further differentiate into mature myofibers. Defects in
nuclear positioning were shown to affect muscle function and are linked to
many muscle diseases, such as Centronuclear Myopathies (CNM) and Emery-
Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD). Nuclear movement during myogenic
differentiation is highly dependent on microtubules (MTs) which adopt a unique
organization during the muscle differentiation process. In comparison to
proliferating myoblasts, where MTs are radially nucleated from the centrosome,
MTs are nucleated from the NE in dense bundles parallel to the cell axis in
differentiated myotubes. This dramatic reorganization of the MT network during
muscle development is accompanied by a redistribution of the Golgi complex and
proteins from the centrosome (e.g. Pericentrin, Pcm1, Akap450) to the NE.
Thus, the nucleus takes over the function as a non-centrosomal microtubule-
organizing center (MTOC) during myogenic differentiation. However, the
molecular mechanisms underlying centrosomal protein recruitment and anchoring
to the NE as well as their capacity to organize MTs are still unknown. Here,
we performed a siRNA screen against 299 genes encoding NE-transmembrane or NE-
associated proteins and identified Nesprin-1, a KASH (Klarsicht/ANC-1/SYNE
homology) domain protein located at the outer nuclear membrane (ONM), involved
in the recruitment of Pericentrin to the NE during myogenic differentiation.
In C2C12 myotubes depleted for Nesprin-1 or in myotubes from a congenital
muscular dystrophy patient carrying a nonsense mutation within the
Nesprin-1/SYNE1 (23560 G>T) gene, several centrosomal proteins, including
Pericentrin, Akap450, Pcm1, and Cdk5Rap2, are mislocalized in the cytoplasm in
close proximity to mislocalized Golgi fragments. During skeletal muscle
formation, a muscle-specific isoform of Nesprin-1, namely Nesprin-1alpha, is
increasingly expressed. Using the proximity-dependent biotin identification
method, BioID, we could show that Nesprin-1alpha is highly associated with
Akap450, Pericentrin and Pcm1 in C2C12 myotubes. Moreover, re-expression of
Nesprin-1alpha in Nesprin-1-depleted cells is sufficient to rescue the
observed recruitment defects, thus confirming Nesprin-1alpha as the major
receptor at the NE to anchor centrosomal proteins. However, Nesprin-1alpha
together with Sun1/Sun2 are not only important for recruiting centrosomal
proteins but also for MTOC activity. MTs are nucleated from the NE in
differentiated muscle cells, whereas MTs grow from cytoplasmic foci containing
mislocalized Golgi fragments and centrosomal proteins in Nesprin-1- or
Sun1/Sun2-depleted cells. Among the recruited centrosomal proteins, solely
Akap450 seems to be required for MT nucleation from the NE. Using computer
simulations and knockdown experiments, we demonstrate that Akap450-Nesprin-
1alpha-mediated MT nucleation from the nucleus has a biological relevance for
nuclear positioning during myotube formation. Taken together, our data suggest
a model where Nesprin-1alpha, when upregulated during myogenic
differentiation, forms a complex with Sun1/Sun2 and thereby anchors
centrosomal proteins at the nucleus. In turn, Akap450 plays a key role in
inducing MT nucleation, thereby assuring proper nuclear positioning during
skeletal muscle formation. These findings strengthen our understanding on how
non-centrosomal MTOCs form in muscle and how defects within the underlying
mechanism can potentially contribute to nuclear positioning defects in
muscular dystrophies.
de
dc.description.abstract
Die korrekte Position des Zellkerns ist für viele biologische Prozesse, z.B.
während der Zellmigration oder der Differenzierung, wichtig und erfordert
Verbindungen zwischen der Kernmembran und dem Zytoskelett. Die Positionierung
des Zellkerns ist vor allem während der Bildung des Skelettmuskels streng
kontrolliert, wenn postmitotische Myoblasten miteinander fusionieren, um
multinukleäre Myotuben zu bilden, und wenn Myotuben weiter in reife
Muskelfasern differenzieren. Fehlpositionierte Zellkerne stehen im Verdacht,
die Muskelfunktion zu beeinträchtigen und hängen somit oft mit verschiedenen
Muskelerkrankungen, wie z.B. der zentronukleären Myopathie und der Emery-
Dreifuss-Muskeldystrophie, zusammen. Die Bewegung von Zellkernen ist während
der myogenen Differenzierung von Mikrotubuli abhängig, die während des
Differenzierungsprozesses umfangreich umorganisiert werden. Während
Mikrotubuli in proliferierenden Myoblasten radial vom Zentrosom nukleiert
werden, werden sie in differenzierten Myotuben von der Kernmembran in dichten,
parallel zur Zellachse verlaufenden, Bündeln nukleiert. Diese drastische
Umstrukturierung des Mikrotubuli-Netzwerkes geht während der Muskelentwicklung
mit einer Umordnung des Golgi-Komplexes und von zentrosomalen Proteinen (z.B.
Pericentrin, Pcm1, Akap450) zur Kernmembran einher. Der Zellkern übernimmt
somit während der myogenen Differenzierung die Funktion eines nicht-
zentrosomalen Mikrotubulus-Organisationszentrums. Der molekulare Mechanismus,
wie zentrosomale Proteine rekrutiert und an der Kernmembran verankert werden,
und wie Zellkerne die Fähigkeit erlangen Mikrotubuli zu organisieren, ist
jedoch bisher ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit haben wir mit Hilfe einer
funktionalen siRNA-Analyse 299 verschiedene Gene untersucht, die
transmembranäre Kernmembranproteine oder Kernmembran-assoziierte Proteine
kodieren. Dabei haben wir Nesprin-1, ein KASH-(Klarsicht/ANC-1/SYNE Homologie)
Domänen-Protein der äußeren Kernmembran, als potenziellen Rezeptor für die
Rekrutierung von Pericentrin zur Kernmembran während der myogenen
Differenzierung identifiziert. In Nesprin-1-defizienten C2C12 Myotuben sowie
in Myotuben von einem Patienten mit kongenitaler Muskeldystrophie (Mutation
innerhalb des Nesprin-1/SYNE1 (23560 G>T) Gens), waren einige zentrosomale
Proteine, Pericentrin, Akap450, Pcm1 und Cdk5Rap2, im Zytoplasma in der Nähe
von mislokalisierten Golgi-Fragmenten fehllokalisiert. Während der Bildung des
Skelettmuskels, wird Nesprin-1alpha, eine muskelspezifische Isoform von
Nesprin-1, verstärkt exprimiert. Mit Hilfe der BioID-Methode konnte gezeigt
werden, dass Nesprin-1alpha stark mit Akap450, Pericentrin und Pcm1 in C2C12
Myotuben assoziiert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die
Reexprimierung von Nesprin-1alpha in Nesprin-1-defizienten Zellen ausreichend
ist, um die beobachteten Rekrutierungsdefekte zentrosomaler Proteine zu
beheben. Nesprin-1alpha konnte somit als wesentlicher Rezeptor für die
Verankerung zentrosomaler Proteine an der Kernmembran bestätigt werden.
Nesprin-1alpha wurde jedoch im Zusammenhang mit Sun1/Sun2 nicht nur für die
Rekrutierung zentrosomaler Proteine als wichtig erwiesen, sondern auch für die
Aktivität des Mikrotubulus-Organisationszentrums. Während Mikrotubuli in
differenzierten Zellen von der Kernmembran nukleiert wurden, wurden sie in
Nesprin-1- oder Sun1/Sun2-defizienten Zellen von zytoplasmatischen Stellen,
die mislokalisierte Golgi-Fragmente und zentrosomale Proteine enthielten,
gebildet. Von den zentrosomalen Proteinen, die bekannt sind, während der
myogenen Differenzierung zur Kernmembran zu lokalisieren, war lediglich
Akap450 benötigt, um die Mikrotubuli-Nukleation an der Kernmembran zu
induzieren. Mit Hilfe von Computersimulationen und Knockdown-Experimenten
konnten wir zeigen, dass die durch Akap450 und Nesprin-1 vermittelte
Mikrotubuli-Nukleation von der Kernmembran eine wichtige Rolle bei der
Positionierung der Zellkerne innerhalb von Myotuben spielt. Zusammengefasst
können wir anhand unserer Daten ein Modell vorschlagen, in dem Nesprin-1alpha,
wenn es während der myogenen Differenzierung hochreguliert wird, einen Komplex
mit Sun1/Sun2 bildet und dabei zentrosomale Proteine am Zellkern verankert.
Anschließend induziert Akap450 die Nukleation von Mikrotubuli an der
Kernmembran und gewährleistet somit die korrekte Positionierung von Zellkernen
während der Bildung des Skelettmuskels. Insgesamt verstärken unsere Ergebnisse
unser allgemeines Verständnis, wie nicht-zentrosomale Mikrotubulus-
Organisationszentren im Muskel gebildet werden und wie Defekte in den
zugrundeliegenden Mechanismen zu potenziellen Fehlern bei der
Zellkernpositionierung in Muskeldystrophien beitragen können.
de
dc.format.extent
XXIV, 179 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
nuclear envelope
dc.subject
nuclear positioning
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Mechanisms of non-centrosomal MTOC formation at the nucleus in muscle cells
dc.contributor.contact
pgimpel87@gmail.com
dc.contributor.inspector
Dr. Edgar R. Gomes,
dc.contributor.inspector
Dr. Michel Bornens,
dc.contributor.inspector
Dr. Christian Kähler,
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Simone Spuler
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Sigmar Stricker,
dc.contributor.furtherReferee
Dr. Mónica Bettencourt-Dias,
dc.contributor.furtherReferee
Dr. Antoine Guichet,
dc.date.accepted
2017-09-04
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105627-3
dc.title.translated
Mechanismen nicht-zentrosomaler MTOC-Bildung am Zellkern in Muskelzellen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000105627
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000022418
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access