Gerodermia Osteodysplastica (GO) is an autosomal recessive segmental progeroid disorder characterized by wrinkled skin and osteoporosis. The molecular cause are mutations in the gene GORAB. The study described here focused on the in vitro and in vivo investigation of the molecular pathophysiology. In in vitro approaches, it was shown that GO patient skin fibroblasts suffered from cellular senescence, with decrease in proliferating cell population, increased in senescence associated beta-galactosidase activity and increase in the cyclinD kinase inhibitor, p16Ink4a, expression. GO patient skin fibroblast and knockdown of GORAB by siRNA in both Hela cells and U2OS cells showed increase in DNA double strand breaks, suggesting that genome instability was the cause of cellular senescence. Upon knockdown of GORAB by siRNA in Hela cells, the cells accumulated significantly higher level of Reactive Oxygen Species (ROS) upon CCCP challenge, suggesting that loss of GORAB increased the cells susceptibility to ROS and could be the cause for increased genome instability. In order to understand the role of Gorab in bone development, a conditional mouse model of Gorab was constructed and crossed with Prx1cre, Col2a1cre, Dmp1cre to inactivate Gorab in the limb bud mesenchyme, cartilage/chondrocyte, and late osetoblast/osteocyte, respectively. The aim was to inactivate the role of Gorab in these tissues to study the contribution of the chondrocytic and osteoblastic lineage to osteoporosis in GO. The Gorabfl/fl;Prx1cre mutants showed the strongest phenotype, with decreased numbers of trabeculae, thinning of cortical bone and shortening of long bones. Gorabfl/fl;Col2a1cre mutants also showed decrease in trabeculae and shortening of long bones comparable to the Gorabfl/fl;Prx1cre mutants, suggesting that the chondrocytic lineage contributed to these phenotypes. Gorabfl/flDmp1cre mutant showed no significant changes in cortical bone thickness and length of long bone, but a significant decrease in trabeculae. This suggested that Gorab inactivation in the late osteoblast /osteocyte did not contribute to the abnormal cortical bone thickness and the dysregulation has its origin in earlier stages in osteoblastogenesis. Analysis of 4 weeks old Gorabfl/fl;Prx1cre mutants showed decrease in mineral apposition rate at the endosteal cortical tibia and increase in osteoid volume and thickness in the trabeculae tibia, indicating that osteoblast function was compromised. qPCR analysis of osteocytes showed increase in expression of late osteoblast marker, Osteopontin and Dmp1, but decrease in osteocytes marker Sclerostin expression, suggesting that osteoblast differentiation was delayed/impaired. It was also found that expression of p21, a cyclinD kinase inhibitor, was increased in the osteocytes, suggesting that cellular senescence may also have taken place upon Gorab inactivation in osteoblast lineage. It was also shown that the TGFβ signaling pathway was activated in GO patient fibroblast, upon GORAB knockdown in Hela and U2OS cells by siRNA and in the osteocytes of 4weeks old Gorabfl/fl;Prx1cre mutants. Suggesting that the TGFβ pathway may participate in cellular senescence and osteoblastogenesis defects upon Gorab inactivation. Taken together, this study has shown that induced cellular senescence and impaired chondrocyte and osteoblast function and differentiation underlied the pathomechanism of GO and the TGFβ signaling was a candidate pathway involved in the phenotype manifestation.
Gerodermia osteodysplastica (GO) ist eine autosomal rezessiv vererbte segmental progeroide Erkrankung, die durch Osteoporose und Faltenbildung der Haut gekennzeichnet ist. Die molekulare Ursache sind Mutationen im Gen GORAB. Die hier beschriebene Studie befasste sich mit in vitro und in vivo Untersuchungen zur molekulare Pathophysiologie. In vitro Experimente ergaben eine verringerte Proliferationsrate GORAB-defizienter Zellen. Als Ursache stellte sich eine vermehrte zelluläre Seneszenz heraus, die sich in erhöhter Expression der Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase und des Zellzyklus- Inhibitors p16Ink4a äußerte. Weitere Untersuchungen zeigten als Ursache für die Seneszenz eine Akkumulation von DNA-Doppelstrangbrüchen und außerdem eine vermehrte Produktion von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) nach Gabe des Mitochondrien-entkoppelnden Protonophors CCCP. Für die in vivo Untersuchung der Funktion von Gorab wurde ein konditionelles Mausmodell etabliert. Durch Kreuzung mit den Linien Prx1cre, Col2a1cre, Dmp1cre sollte eine Inaktivierung des Gens im Mesenchym der Extremitätenknospe, im Knorpel und in späten Osteoblasten/Osteozyten erreicht werden, um die Beiträge der verschiedenen Zelltypen zum GO Phänotyp voneinander zu unterscheiden. Gorabfl/fl;Prx1cre und Gorabfl/fl;Col2a1cre zeigten einen sehr ähnlichen Phänotyp in Röhrenknochen mit einem mild verminderten Wachstum und einer stark verminderten Anzahl von metaphysären Knochentrabekeln. Nur bei Gorabfl/fl;Prx1cre Mutanten konnten auch eine Abnahme der Dicke des kortikalen Knochens und eine auffällige Morphologie der Osteozytenlakunen beobachtet werden. Überraschenderweise zeigte sich kein entsprechender Osteozytenphänotyp nach Ausschalten von Gorab in Osteozyten durch Dmp1cre, sondern lediglich eine leichte Abnahme des trabekulären Knochens. Die detaillierte Analyse der Gorabfl/fl;Prx1cre Mutanten im Alter von 4 Wochen ergab eine verminderte Appositionsrate des Knochens und vermehrtes nicht mineralisiertes Osteoid, was für eine Funktionsstörung der Osteoblasten spricht. Zur näheren Untersuchung dieser Osteoblastenfehlfunktion erfolgte eine Expressionsuntersuchung des kortikalen Knochens, die eine Zunahme der Expression später Osteoblasten-, aber eine Abnahme von Osteozytenmarkern ergab. Zusätzlich zeigte sich eine verstärkte Expression des Zellzyklus-Inhibitors p21 und von TGF-beta 1 und 2. Eine vergleichbare verstärkte TGF-beta Expression fand sich auch in GO Hautfibroblasten und in verschiedenen Zellinien nach GORAB Inaktivierung durch RNA-Interferenz. Insgesamt scheinen die für die Pathogenese des GO Knochenphänotyps verantwortlichen Zelltypen Chondrozyten und Osteoblasten und/oder ihre mesenchymalen Vorläuferzellen zu sein, während die Osteozyten eine untergeordnete Rolle spielen. Auf zellulärer Ebene begünstigt der Verlust von GORAB – vermutlich durch Anhäufung von DNA-Doppelstrangbrüchen - die zelluläre Seneszenz und die Expression von TGF-beta.
