dc.contributor.author
Chan, Wing Lee
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:21:12Z
dc.date.available
2014-01-07T08:53:08.255Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9166
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13365
dc.description.abstract
Gerodermia Osteodysplastica (GO) is an autosomal recessive segmental progeroid
disorder characterized by wrinkled skin and osteoporosis. The molecular cause
are mutations in the gene GORAB. The study described here focused on the in
vitro and in vivo investigation of the molecular pathophysiology. In in vitro
approaches, it was shown that GO patient skin fibroblasts suffered from
cellular senescence, with decrease in proliferating cell population, increased
in senescence associated beta-galactosidase activity and increase in the
cyclinD kinase inhibitor, p16Ink4a, expression. GO patient skin fibroblast and
knockdown of GORAB by siRNA in both Hela cells and U2OS cells showed increase
in DNA double strand breaks, suggesting that genome instability was the cause
of cellular senescence. Upon knockdown of GORAB by siRNA in Hela cells, the
cells accumulated significantly higher level of Reactive Oxygen Species (ROS)
upon CCCP challenge, suggesting that loss of GORAB increased the cells
susceptibility to ROS and could be the cause for increased genome instability.
In order to understand the role of Gorab in bone development, a conditional
mouse model of Gorab was constructed and crossed with Prx1cre, Col2a1cre,
Dmp1cre to inactivate Gorab in the limb bud mesenchyme, cartilage/chondrocyte,
and late osetoblast/osteocyte, respectively. The aim was to inactivate the
role of Gorab in these tissues to study the contribution of the chondrocytic
and osteoblastic lineage to osteoporosis in GO. The Gorabfl/fl;Prx1cre mutants
showed the strongest phenotype, with decreased numbers of trabeculae, thinning
of cortical bone and shortening of long bones. Gorabfl/fl;Col2a1cre mutants
also showed decrease in trabeculae and shortening of long bones comparable to
the Gorabfl/fl;Prx1cre mutants, suggesting that the chondrocytic lineage
contributed to these phenotypes. Gorabfl/flDmp1cre mutant showed no
significant changes in cortical bone thickness and length of long bone, but a
significant decrease in trabeculae. This suggested that Gorab inactivation in
the late osteoblast /osteocyte did not contribute to the abnormal cortical
bone thickness and the dysregulation has its origin in earlier stages in
osteoblastogenesis. Analysis of 4 weeks old Gorabfl/fl;Prx1cre mutants showed
decrease in mineral apposition rate at the endosteal cortical tibia and
increase in osteoid volume and thickness in the trabeculae tibia, indicating
that osteoblast function was compromised. qPCR analysis of osteocytes showed
increase in expression of late osteoblast marker, Osteopontin and Dmp1, but
decrease in osteocytes marker Sclerostin expression, suggesting that
osteoblast differentiation was delayed/impaired. It was also found that
expression of p21, a cyclinD kinase inhibitor, was increased in the
osteocytes, suggesting that cellular senescence may also have taken place upon
Gorab inactivation in osteoblast lineage. It was also shown that the TGFβ
signaling pathway was activated in GO patient fibroblast, upon GORAB knockdown
in Hela and U2OS cells by siRNA and in the osteocytes of 4weeks old
Gorabfl/fl;Prx1cre mutants. Suggesting that the TGFβ pathway may participate
in cellular senescence and osteoblastogenesis defects upon Gorab inactivation.
Taken together, this study has shown that induced cellular senescence and
impaired chondrocyte and osteoblast function and differentiation underlied the
pathomechanism of GO and the TGFβ signaling was a candidate pathway involved
in the phenotype manifestation.
de
dc.description.abstract
Gerodermia osteodysplastica (GO) ist eine autosomal rezessiv vererbte
segmental progeroide Erkrankung, die durch Osteoporose und Faltenbildung der
Haut gekennzeichnet ist. Die molekulare Ursache sind Mutationen im Gen GORAB.
Die hier beschriebene Studie befasste sich mit in vitro und in vivo
Untersuchungen zur molekulare Pathophysiologie. In vitro Experimente ergaben
eine verringerte Proliferationsrate GORAB-defizienter Zellen. Als Ursache
stellte sich eine vermehrte zelluläre Seneszenz heraus, die sich in erhöhter
Expression der Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase und des Zellzyklus-
Inhibitors p16Ink4a äußerte. Weitere Untersuchungen zeigten als Ursache für
die Seneszenz eine Akkumulation von DNA-Doppelstrangbrüchen und außerdem eine
vermehrte Produktion von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) nach Gabe des
Mitochondrien-entkoppelnden Protonophors CCCP. Für die in vivo Untersuchung
der Funktion von Gorab wurde ein konditionelles Mausmodell etabliert. Durch
Kreuzung mit den Linien Prx1cre, Col2a1cre, Dmp1cre sollte eine Inaktivierung
des Gens im Mesenchym der Extremitätenknospe, im Knorpel und in späten
Osteoblasten/Osteozyten erreicht werden, um die Beiträge der verschiedenen
Zelltypen zum GO Phänotyp voneinander zu unterscheiden. Gorabfl/fl;Prx1cre und
Gorabfl/fl;Col2a1cre zeigten einen sehr ähnlichen Phänotyp in Röhrenknochen
mit einem mild verminderten Wachstum und einer stark verminderten Anzahl von
metaphysären Knochentrabekeln. Nur bei Gorabfl/fl;Prx1cre Mutanten konnten
auch eine Abnahme der Dicke des kortikalen Knochens und eine auffällige
Morphologie der Osteozytenlakunen beobachtet werden. Überraschenderweise
zeigte sich kein entsprechender Osteozytenphänotyp nach Ausschalten von Gorab
in Osteozyten durch Dmp1cre, sondern lediglich eine leichte Abnahme des
trabekulären Knochens. Die detaillierte Analyse der Gorabfl/fl;Prx1cre
Mutanten im Alter von 4 Wochen ergab eine verminderte Appositionsrate des
Knochens und vermehrtes nicht mineralisiertes Osteoid, was für eine
Funktionsstörung der Osteoblasten spricht. Zur näheren Untersuchung dieser
Osteoblastenfehlfunktion erfolgte eine Expressionsuntersuchung des kortikalen
Knochens, die eine Zunahme der Expression später Osteoblasten-, aber eine
Abnahme von Osteozytenmarkern ergab. Zusätzlich zeigte sich eine verstärkte
Expression des Zellzyklus-Inhibitors p21 und von TGF-beta 1 und 2. Eine
vergleichbare verstärkte TGF-beta Expression fand sich auch in GO
Hautfibroblasten und in verschiedenen Zellinien nach GORAB Inaktivierung durch
RNA-Interferenz. Insgesamt scheinen die für die Pathogenese des GO
Knochenphänotyps verantwortlichen Zelltypen Chondrozyten und Osteoblasten
und/oder ihre mesenchymalen Vorläuferzellen zu sein, während die Osteozyten
eine untergeordnete Rolle spielen. Auf zellulärer Ebene begünstigt der Verlust
von GORAB – vermutlich durch Anhäufung von DNA-Doppelstrangbrüchen - die
zelluläre Seneszenz und die Expression von TGF-beta.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Gerodermia Osteodysplastica
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::616 Krankheiten
dc.title
Molecular basis of Gerodermia Osteodysplastica, a premature ageing disorder
dc.contributor.contact
hardywlchan@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Stefan Mundlos
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Petra Knaus
dc.date.accepted
2012-03-12
dc.date.embargoEnd
2013-12-31
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038135-5
dc.title.translated
Molekulare Grundlagen der Gerodermia Osteodysplastica, einer Erkrankung mit
vorzeitiger Alterung
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000038135
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011422
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access