Aufklärung molekularer Pathogenesemechanismen des Norrie-Syndroms

Abstract

# Zusammenfassung

Das Norrie-Syndrom ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte, kongenitale Blindheit, die mit Taubheit und geistiger Behinderung assoziiert sein kann. In dieser Arbeit sollten molekulare Pathogenesemechanismen dieses Syndroms am Ndph-knockout-Mausmodell aufgeklärt werden. Dabei wurden Expressionsanalysen aber auch histologische und proteinbiochemische Techniken für die Charakterisierung der betroffenen Organe, Auge und Gehirn, angewandt. Die Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken aus Augen (p21) und deren Charakterisierung mit Mikroarrays sowie Blot-Hybridisierungen führten nicht zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Dies hängt möglicherweise mit geringen Unterschieden in der Genexpression in diesem frühen Entwicklungsstadium zusammen. Dennoch konnten wir mit quantitativer Real Time- RT-PCR zeigen, dass während der postnatalen Entwicklung der Retina viele Angiogenesefaktoren transkriptionell inhibiert oder stimuliert werden. Dadurch wurde nachgewiesen, dass Endothelzellen durch das Fehlen von Norrin in ihrer extrazellulären Umgebung initial betroffen sind und die Entwicklung der tiefen Kapillarnetzwerke in der inneren Retina blockiert wird. Dies führt zu einer Hypoxie (Sauerstoffmangel) ab p10, die hier als ein wesentlicher Pathogenesefaktor des Norrie-Syndroms identifiziert werden konnte. Diese Befunde können auch ähnliche Symptome bei familiärer exsudativer Vitreoretinopathie (FEVR), bei Morbus Coats und bei Frühgeborenenretinopathie (ROP) erklären. Globale Genexpressionsstudien im Gehirn des Mausmodells identifizierten eine reduzierte Wachstumshormonexpression. Diese trat nur im Gehirn und nicht in der Hypophyse auf, die das endokrinologisch wirksame Wachstumshormon (Gh) produziert. Die hirnspezifische Reduktion des Gh- Transkripts könnte eine mögliche Erklärung für die geistige Behinderung in Norrie-Patienten liefern, wobei der genaue molekulare Zusammenhang noch aufzuklären ist. Ein weiterer, neuer Befund war die Infertilität homozygoter Ndph-knockout-Weibchen. Als deren Ursache konnte eine gestörte Deziduaentwicklung ausgemacht werden. Um E7 verursachen mütterliche Einblutungen in die Dezidua den Verlust der Embryonen. Die hier nachgewiesene Expression von Ndph/NDP in Maus-Deziduae und humaner Plazenta weist auf eine wichtige Funktion des Gens in der weiblichen Reproduktion hin. Schließlich wurde rekombinantes Norrin hergestellt. Die damit gewonnen polyklonalen Antiseren erkannten das Antigen, detektierten aber in Gewebehomogenaten kein Norrin. Die funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Norrins im Cornea-Vaskularisations�Assay erbrachte keinen Nachweis einer Funktion des Norrins in der Angiogenese. Insgesamt wiesen die hier gewonnenen Daten Angiogenesedefekte als wichtige Grundlage der Pathogenese des Norrie-Syndroms nach.

# Summary

Norrie disease (ND) is a rare X-linked recessive congenital blindness, sometimes associated with deafness and mental retardation. In this thesis the molecular pathogenic mechanisms of this syndrome should be elucidated using the Ndph knockout mouse model. Gene expression studies but also histology and protein biochemistry were used to characterize the affected organs, eye and brain. Gene expression analyses of eyes at p21 using cDNA subtraction in combination with microarrays and blot hybridization did not lead to the identification of differentially expressed genes. This might be due to low expression differences early on in the disease. However with quantitative Real Time RT-PCR we could show differential expression of many angiogenic factors during postnatal retinal development, suggesting an early effect of Norrin in the extracellular matrix on endothelial cells. Its lack leads to the block in the development of deep retinal capillary networks. Subsequently hypoxia develops after p10, which we could show to be an important pathogenic factor for Norrie disease. It is likely that it is also the molecular basis for similarities of the clinical Symptoms of the related diseases familial exudative vitreoretinopathie, coats disease and retinopathy of prematurity. Global gene expression studies in the brain of ND-mice identified a reduction of growth hormone expression. This reduction occurs specifically in the brain, but not in pituitary, where the endocrine active growth hormone (Gh) is produced. The brain-specific reduction of the Gh transcript might provide for the first time a possible explanation for the mental retardation in Norrie disease patients, although the molecular link remains to be elucidated. Also for the first time, the infertility of homozygous Ndph knockout female mice was found. The underlying cause was identified to be a disturbance in decidualization. Around E7 maternal bleedings into implantation sites have been discovered leading to loss of embryos by resorption. Additionally, the expression of Ndph/NDP in deciduae of mice and in human placenta also suggested an important function of this gene in female reproduction. In addition, recombinant Norrin was produced. The obtained polyclonal anti-sera detected the antigen but could not detect Norrin in tissue homogenates. The functional characterization of the recombinant Norrin in a cornea vascularization assay could not prove the role of Norrin in angiogenesis. Altogether the here obtained data suggested angiogenic defects as an important basis for pathogenesis in Norrie disease.