id,collection,dc.contributor.author[],dc.contributor.firstReferee[],dc.contributor.furtherReferee[],dc.contributor.gender[],dc.date.accepted[],dc.date.accessioned[],dc.date.available[],dc.date.embargoEnd[],dc.date.issued[],dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.description[],dc.identifier.uri,dc.identifier.uri[],dc.identifier.urn[],dc.language[],dc.rights.uri[],dc.subject.ddc,dc.subject[],dc.title.translated[en],dc.title[],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId[],refubium.mycore.fudocsId[],refubium.mycore.transfer[] "a2af52df-6860-4dfb-a95c-bbcb75ded855","fub188/14","Luhmann, Ulrich F. O.","Professor Dr. Wolfgang Berger","Professor Dr. Volker A. Erdmann","n","2005-06-10","2018-06-07T22:17:56Z","2005-07-04T00:00:00.649Z","2005-07-06","2005","# Zusammenfassung Das Norrie-Syndrom ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte, kongenitale Blindheit, die mit Taubheit und geistiger Behinderung assoziiert sein kann. In dieser Arbeit sollten molekulare Pathogenesemechanismen dieses Syndroms am Ndph-knockout-Mausmodell aufgeklärt werden. Dabei wurden Expressionsanalysen aber auch histologische und proteinbiochemische Techniken für die Charakterisierung der betroffenen Organe, Auge und Gehirn, angewandt. Die Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken aus Augen (p21) und deren Charakterisierung mit Mikroarrays sowie Blot-Hybridisierungen führten nicht zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Dies hängt möglicherweise mit geringen Unterschieden in der Genexpression in diesem frühen Entwicklungsstadium zusammen. Dennoch konnten wir mit quantitativer Real Time- RT-PCR zeigen, dass während der postnatalen Entwicklung der Retina viele Angiogenesefaktoren transkriptionell inhibiert oder stimuliert werden. Dadurch wurde nachgewiesen, dass Endothelzellen durch das Fehlen von Norrin in ihrer extrazellulären Umgebung initial betroffen sind und die Entwicklung der tiefen Kapillarnetzwerke in der inneren Retina blockiert wird. Dies führt zu einer Hypoxie (Sauerstoffmangel) ab p10, die hier als ein wesentlicher Pathogenesefaktor des Norrie-Syndroms identifiziert werden konnte. Diese Befunde können auch ähnliche Symptome bei familiärer exsudativer Vitreoretinopathie (FEVR), bei Morbus Coats und bei Frühgeborenenretinopathie (ROP) erklären. Globale Genexpressionsstudien im Gehirn des Mausmodells identifizierten eine reduzierte Wachstumshormonexpression. Diese trat nur im Gehirn und nicht in der Hypophyse auf, die das endokrinologisch wirksame Wachstumshormon (Gh) produziert. Die hirnspezifische Reduktion des Gh- Transkripts könnte eine mögliche Erklärung für die geistige Behinderung in Norrie-Patienten liefern, wobei der genaue molekulare Zusammenhang noch aufzuklären ist. Ein weiterer, neuer Befund war die Infertilität homozygoter Ndph-knockout-Weibchen. Als deren Ursache konnte eine gestörte Deziduaentwicklung ausgemacht werden. Um E7 verursachen mütterliche Einblutungen in die Dezidua den Verlust der Embryonen. Die hier nachgewiesene Expression von Ndph/NDP in Maus-Deziduae und humaner Plazenta weist auf eine wichtige Funktion des Gens in der weiblichen Reproduktion hin. Schließlich wurde rekombinantes Norrin hergestellt. Die damit gewonnen polyklonalen Antiseren erkannten das Antigen, detektierten aber in Gewebehomogenaten kein Norrin. Die funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Norrins im Cornea-Vaskularisations�Assay erbrachte keinen Nachweis einer Funktion des Norrins in der Angiogenese. Insgesamt wiesen die hier gewonnenen Daten Angiogenesedefekte als wichtige Grundlage der Pathogenese des Norrie-Syndroms nach.","# Summary Norrie disease (ND) is a rare X-linked recessive congenital blindness, sometimes associated with deafness and mental retardation. In this thesis the molecular pathogenic mechanisms of this syndrome should be elucidated using the Ndph knockout mouse model. Gene expression studies but also histology and protein biochemistry were used to characterize the affected organs, eye and brain. Gene expression analyses of eyes at p21 using cDNA subtraction in combination with microarrays and blot hybridization did not lead to the identification of differentially expressed genes. This might be due to low expression differences early on in the disease. However with quantitative Real Time RT-PCR we could show differential expression of many angiogenic factors during postnatal retinal development, suggesting an early effect of Norrin in the extracellular matrix on endothelial cells. Its lack leads to the block in the development of deep retinal capillary networks. Subsequently hypoxia develops after p10, which we could show to be an important pathogenic factor for Norrie disease. It is likely that it is also the molecular basis for similarities of the clinical Symptoms of the related diseases familial exudative vitreoretinopathie, coats disease and retinopathy of prematurity. Global gene expression studies in the brain of ND-mice identified a reduction of growth hormone expression. This reduction occurs specifically in the brain, but not in pituitary, where the endocrine active growth hormone (Gh) is produced. The brain-specific reduction of the Gh transcript might provide for the first time a possible explanation for the mental retardation in Norrie disease patients, although the molecular link remains to be elucidated. Also for the first time, the infertility of homozygous Ndph knockout female mice was found. The underlying cause was identified to be a disturbance in decidualization. Around E7 maternal bleedings into implantation sites have been discovered leading to loss of embryos by resorption. Additionally, the expression of Ndph/NDP in deciduae of mice and in human placenta also suggested an important function of this gene in female reproduction. In addition, recombinant Norrin was produced. The obtained polyclonal anti-sera detected the antigen but could not detect Norrin in tissue homogenates. The functional characterization of the recombinant Norrin in a cornea vascularization assay could not prove the role of Norrin in angiogenesis. Altogether the here obtained data suggested angiogenic defects as an important basis for pathogenesis in Norrie disease.","# I. # Inhaltsverzeichnis # 0. Titelblatt, Danksagung und Verzeichnisse ### I. ### INHALTSVERZEICHNIS ### IV ### II. ### ABBILDUNGSVERZEICHNIS ### VII ### III. ### ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ### IX 1 EINLEITUNG 1 ### 1.1 ### Die Anatomie des menschlichen Auges ### 1 #### 1.1.1 #### Der Aufbau der Retina und deren Blutgefäßversorgung #### 2 ### 1.2 ### Klinik und Genetik des Norrie-Syndroms ### 5 #### 1.2.1 #### Das klinische Erscheinungsbild des Norrie-Syndroms #### 5 #### 1.2.2 #### Das NDP-Gen und sein Mutationsspektrum in Patienten #### 7 #### 1.2.3 #### Klinische Gemeinsamkeiten der allelischen Erkrankungen und deren genetische Grundlagen #### 9 ### 1.3 ### Eigenschaften des vorhergesagten NDP-Proteins (Norrin) ### 12 ### 1.4 ### Das Ndph-knockout-Mausmodell ### 15 #### 1.4.1 #### Die Herstellung eines Mausmodells für das Norrie-Syndrom und die Expression des Norrie-Gens in Mausgewebe #### 15 #### 1.4.2 #### Phänotypische Charakterisierung des Mausmodells #### 15 ### 1.5 ### Die retinale Blutgefäßentwicklung in Mensch und Maus ### 17 #### 1.5.1 #### Die Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Mensch und Maus #### 17 #### 1.5.2 #### Die Rolle der an der retinalen Blutgefäßentwicklung beteiligten Zelltypen #### 20 #### 1.5.3 #### Die koordinierte Wirkung molekularer Signalwege in der Angiogenese #### 22 ### 1.6 ### Zielsetzung der Arbeit ### 25 2 MATERIAL / METHODEN 26 ### 2.1 ### Tiere ### 26 ### 2.2 ### Gewebepräparation und histologische Techniken ### 26 #### 2.2.1 #### Entnahme und Verarbeitung von Geweben #### 27 #### 2.2.2 #### Fixierung und Paraffineinbettung von Gewebe #### 27 #### 2.2.3 #### Hämalaun/Eosin-Färbung #### 27 ### 2.3 ### DNA-Techniken ### 28 #### 2.3.1 #### Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren #### 30 #### 2.3.2 #### Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) #### 30 #### 2.3.3 #### Präparation von Plasmid-DNA #### 31 #### 2.3.4 #### Manipulation von DNA und Transformation von Bakterien #### 31 #### 2.3.5 #### Sequenzierung #### 32 #### 2.3.6 #### Isolation von DNA aus Mausschwanzbiopsien #### 33 #### 2.3.7 #### PCR zur Genotypisierung des Ndph-Wildtyp- oder Knockout-Allels und zur Geschlechtsbestimmung (Sry) #### 33 ### 2.4 ### RNA-Techniken ### 34 #### 2.4.1 #### RNA-Extraktion #### 36 #### 2.4.2 #### Quantifizierung der RNA #### 37 #### 2.4.3 #### DNase I-Behandlung von Total-RNA #### 37 #### 2.4.4 #### DNAse I-Behandlung von Total-RNA (20 μg) mit anschließender Phenol- Chloroform-Extraktion #### 38 #### 2.4.5 #### cDNA-Synthese #### 38 #### 2.4.6 #### TaqMan-Real Time-PCR #### 39 #### 2.4.7 #### Nicht radioaktive RNA-in situ Hybridisierung (DIG) auf Gewebeschnitten #### 40 #### 2.4.8 #### Genexpressionsstudien mit Northern Blots oder virtuellen Northern Blots #### 46 #### 2.4.9 #### Herstellen radioaktiv markierter DNA-Sonden und Hybridisierung von Nukleinsäureblots #### 48 ### 2.5 ### Herstellen einer SMART-cDNA-Subtraktionsbank ### 51 #### 2.5.1 #### Erststrang-SMART-cDNA-Synthese (Smart PCR cDNA Synthesis Kit) #### 56 #### 2.5.2 #### RsaI-Restriktion der SMART-cDNAs #### 58 #### 2.5.3 #### Herstellung des Drivers #### 59 #### 2.5.4 #### Herstellen der Tester #### 60 #### 2.5.5 #### Subtraktive Hybridisierung #### 62 #### 2.5.6 #### ""Suppression PCR""-Amplifikation der differentiellen Tester cDNA-Fragmente #### 63 #### 2.5.7 #### Herstellen der Forward- und der Reverse-SMART-cDNA-Subtraktionsbanken #### 65 ### 2.6 ### cDNA-Mikroarray-Techniken ### 66 #### 2.6.1 #### Amplifikation der SMART-cDNA-Subtraktionsbanken zur Herstellung von Mikroarrays #### 68 #### 2.6.2 #### Herstellen der cDNA-Mikroarrays #### 69 #### 2.6.3 #### In dieser Arbeit hergestellte bzw. verwendete cDNA-Mikroarrays #### 70 #### 2.6.4 #### Vorbehandlung der Mikroarrays für die Hybridisierung #### 71 #### 2.6.5 #### Vorbereitung der Targets für die Markierung #### 72 #### 2.6.6 #### Markierung der Targets #### 73 #### 2.6.7 #### Kohybridisierung verschiedener Targets auf cDNA-Mikroarrays #### 76 #### 2.6.8 #### Waschen der Mikroarrays nach der Hybridisierung #### 78 #### 2.6.9 #### Bildgewinnung und Analyse der Mikroarraydaten #### 78 ### 2.7 ### Proteinbiochemische Methoden ### 79 #### 2.7.1 #### Proteinpräparation aus Gewebe #### 82 #### 2.7.2 #### Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA- Assay; 560 nm) #### 83 #### 2.7.3 #### Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS�PAGE) #### 83 #### 2.7.4 #### Nachweis von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen #### 84 #### 2.7.5 #### Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran (Western Blot) #### 84 #### 2.7.6 #### Rekombinante Ndph (""Norrin"")-Proteinexpression in Escherichia coli #### 85 #### 2.7.7 #### Affinitätschromatographische Aufreinigung des rekombinanten Proteins mit Ni-NTA-Agarose über einen RGS-His-Tag #### 88 #### 2.7.8 #### Immunisierung von Kaninchen mit rekombinantem Norrin zur Antikörpergewinnung #### 89 #### 2.7.9 #### Renaturierung des rekombinanten WND-Proteins für die Verwendung in einem Cornea- Vaskularisations-Assay #### 89 ### 2.8 ### Datenbankanalysen und Computerprogramme ### 90 3 ERGEBNISSE 91 ### 3.1 ### Globale Genexpressionsstudien in Augen von Ndph-knockout-Mäusen (p21) ### 91 #### 3.1.1 #### Herstellung einer Forward- und einer Reverse-cDNA-Subtraktionsbank 91 #### 91 #### 3.1.2 #### Herstellung von cDNA-Mikroarrays 97 #### 97 ### 3.2 ### cDNA-Mikroarray-Hybridisierungsexperimente zur Identifizierung ### von differentiell exprimierten Genen. ### 100 #### 3.2.1 #### Vergleichende Datenanalyse der cDNA-Mikroarraydaten 104 #### 104 #### 3.2.2 #### Verifizierung der Arraydaten mit Hilfe virtueller Northern Blots 112 #### 112 ### 3.3 ### Die postnatale Entwicklung der retinalen Blutgefäße in Ndph-knockout- Mäusen ### 113 #### 3.3.1 #### Histologische Untersuchung der Retinaentwicklung in Ndph-knockout-Mäusen #### 113 #### 3.3.2 #### Expression von Angiogenesefaktoren während der postnatalen Retinaentwicklung #### 115 ### 3.4 ### Histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen im Gehirn von Ndph-knockout-Mäusen ### 120 #### 3.4.1 #### Histologische Untersuchungen im Gehirn #### 120 #### 3.4.2 #### Analyse der Genexpression im Gehirn mit Hilfe eines cDNA-Mikroarrays #### 122 #### 3.4.3 #### Entwicklungsabhängige Transkription des Wachstumshormon-Gens im Gehirn. #### 125 #### 3.4.4 #### Expression des Wachstumshormons in der Hypophyse #### 126 #### 3.4.5 #### Expression zweier Markergene in der Leber für die Gh-Serum-Wirkung #### 127 #### 3.4.6 #### Korrelation zwischen der mRNA-Expression von Ndph und Gh in verschiedenen Hirnregionen. #### 129 #### 3.4.7 #### Untersuchungen zur Transkription von Gh in Auge und Retina #### 132 ### 3.5 ### Identifizierung eines aberranten Ndph-Transkripts in hemizygoten Ndphy/--Mäusen. ### 133 ### 3.6 ### Die Ursache der Infertilität von homozygoten Ndph-/--Weibchen ### 136 #### 3.6.1 #### Die Transmission des Ndph-knockout-Allels in der Knockout-Mauslinie #### 136 #### 3.6.2 #### Histologische Studien an den Implantationsstellen/ Deziduae im Uterus von Ndph-/--Weibchen nach der Einnistung. #### 137 #### 3.6.3 #### Die Expression von NDP/Ndph in Reproduktionsorganen #### 139 ### 3.7 ### Expression eines rekombinanten Ndph-Proteins (Norrin) in Escherichia coli ### 140 ### 3.8 ### Herstellung polyklonaler Antikörper für Norrin ### 142 ### 3.9 ### Cornea-Vaskularisations-Assay mit rekombinantem Norrin ### 145 4 DISKUSSION 147 ### 4.1 ### Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Auge ### 147 #### 4.1.1 #### Herstellung von cDNA-Subtraktionsbanken und deren Charakterisierung mit Hilfe der Mikroarray-Technik. #### 147 #### 4.1.2 #### Die postnatale Retinaentwicklung in Wildtyp und in Ndph-knockout-Mäusen und die Hypoxie #### als wesentlicher Pathogenesemechanismus des Norrie-Syndroms. #### 149 #### 4.1.3 #### Die molekulare Wirkung des Ndph-Gens im Auge #### 155 ### 4.2 ### Die Untersuchungen zur Funktion des Ndph-Gens im Gehirn � Die Dysregulation des Wachstumshormons im Gehirn könnte dem Phänotyp der mentalen Retardierung zu Grunde liegen ### 158 #### 4.2.1 #### Histologische Untersuchung des Gehirns #### 158 #### 4.2.2 #### Globale Genexpressionsstudien im Gehirn von Wildtyp- und Ndph-knockout- Mäusen #### 158 #### 4.2.3 #### Differentielle Genexpression in verschiedenen Hirnregionen als mögliche Ursache der geistigen Behinderung in Norrie-Patienten. #### 160 #### 4.2.4 #### Die Detektion eines artifiziellen Ndph-Fusionstranskripts in Ndph- knockout-Mäusen und die Konsequenzen für das Mausmodell. #### 163 ### 4.3 ### Untersuchungen zur Rolle des Norrins für die Fertilität ### 164 #### 4.3.1 #### Genotypenverteilung #### 165 #### 4.3.2 #### Die Rolle des Norrins während der Dezidua-Bildung #### 165 ### 4.4 ### Rekombinante Expression des Norrins und die Herstellung von Antikörper ### 167 ### 4.5 ### Cornea-Vaskularisations-Assay ### 168 ### 4.6 ### Die Pathogenese des Norrie-Syndroms und die molekulare Wirkung des ### Norrie disease pseudoglioma-Gens/Proteins (�Norrins�) - Ein Ausblick ### 169 5 ZUSAMMENFASSUNG 173 6 SUMMARY 174 7 REFERENZEN 175 8 VERÖFFENTLICHUNGEN 184 ### 8.1 ### Wissenschaftliche Veröffentlichungen ### 184 ### 8.2 ### Kongressbeiträge ### 184 9 LEBENSLAUF 186 10 ANHANG 187 ### 10.1 ### Korrelation der Phänotypen mit Substitutionsmutationen im NDP-Gen ### 187 ### 10.2 ### In dieser Arbeit verwendete Primer ### 190 ### 10.3 ### Sequenz des Ndph-knockout-Transkripts ### 193","http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13296","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9097","urn:nbn:de:kobv:188-2005001639","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie","Norrie disease mouse model||retinal angiogenesis||infertility||congenital blindness||mental retardation","Elucidation of Molecular Pathogenic Mechanisms of Norrie Disease","Aufklärung molekularer Pathogenesemechanismen des Norrie-Syndroms","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000001679","FUDISS_thesis_000000001679","http://www.diss.fu-berlin.de/2005/163/"