Expression of estrogen receptor-related receptor á, â and ã, a subfamily of orphan nuclear receptors, the role in ovarian cancer cells

Abstract

Objective: Ovarian cancer can be considered as an endocrine-related cancer. The pleiotropic effects of estrogen are mediated by estrogen receptor ERα and ERβ. However, expression rates of ERs are limited of prognostic values. A subfamily of orphan receptors, estrogen receptor-related receptors (ERRs), has been demonstrated to modulate transcription of some estrogen responsive genes via variants estrogen responsive elements (EREs). This study was performed to determine whether human estrogen receptor-related receptor -α, -β, -γ and their isoformal transcripts (hERRα-1 and hERRβ-2) might be associated with ovarian cancers. The association between the expression of ERRs and clinicopatholigical parameters were also analyzed. Materials and Methods: To analyze the subcellular location of ERRs, a Green Fluorescent Protein (GFP)-reporter plasmid of hERRα was constructed and transfected into the cell lines SKOV-3 and OVCAR-3. To distinguish the cellular cytoplasm and nucleus, DAPI staining was performed. A Double-color confocal scan microscope was used to observe the reporter signal. Western-Blot analysis was performed to detect the HA-tag-hERRγ fusion protein in the transfected cell lines. Two-step LightCycler real-time RT-PCR was used to quantitatively analyze the expression of hERRα, hERRβ, hERRγ ,hERα and hERβ mRNA in ovarian cancer cell lines SKOV-3, OVCAR-3 OAW-42, MDAH-2774, ES-2 as well as 33 primary ovarian cancer samples and 12 normal ovarian tissue samples. The immunochemistry and immunohistology were also used to detect the ERRs protein expression. The serum CA-125 was detected in all samples by ELISA assay. To discuss the potential role of ERRs as biomarkers in ovarian cancer, the expressions of ERRs family were analyzed with multi-clinicopathological parameters and overall survival analysis. Progression-free survival time and overall survival time of patients with different expression of ERRs were analyzed by the Kaplan-Meier method. Results: hERRα-GFP fusion protein showed hERRα expressed chiefly in the cell nucleus. In ovarian cancers, 19 cases (57.6%) were hERRα mRNA and protein positive-expression, 3 cases (9.1%) were hERRβ mRNA and protein positive- expression and 16 cases (48.5%) were hERRγ mRNA and protein positive- expression; in normal ovaries 2 cases (16.7%), 0 cases (0%) and 4 cases (33.3%), respectively. Compared with the normal ovaries, higher expression rate of hERRα and hERRγ were detected in patients with ovarian cancer (p=0.002 and p=0.045). A high co-expression of hERα and hERRα was found in the ovarian cancer. High expression of ERRα seems to be associated with a lower expression of hERα. Compared with normal ovaries, the ratio of hERα/hERRα seems to be decreased in the ovarian cancer. Combination of the hERRα expression and serum CA-125 level analysis showed CA-125 level in hERRα positive-group (1954.79 U/ml) was significantly higher than in the hERRα negative-group (448.56 U/ml) (p=0.012); However, the difference of serum CA125 levels between hERRβ positive - and negative- group (p=0.795) and hERRγ positive- and negative- group (p=0.515) are not significant. In the multivariate analysis, expression of hERRα was an independent prognostic factor for poor survival (RI, 3.02: 95% CI: 1.27 to 6.06). High expression of hERRα is associated with increasing serum CA-125, advanced FIGO stage, poor differentiation (grade) and decreased overall survival time. High expression of hERRγ is associated with early FIGO stage (p=0,040) and longer progression-free survival time (p=0,020). Moreover, increasing expression of hERRγ tends to be correlated with decreased serum CA-125 and low ascites volume. Survival analysis showed that the hERRα- positive group had a reduced overall survival time (p=0.015) whereas the hERRγ-positive group showed a longer progression-free survival time (p=0.020). Conclusion: Based on the results showed in my dissertation, I concluded follows: ERRs are highly expressed in the cell nucleus of ovarian cancer samles. Both hERRα and hERRγ seem to play an important role in the ovarian cancer. High expression of hERRα is strongly associated with more advanced clinical stages of ovarian cancer and more aggressive malignant biological behavior. Moreover, hERRα and hERRγ are potential endocrinal therapy targets of ovarian cancer.

Einleitung: Das Ovarialkarzinom kann als ein endokrinologisch-assoziierter Tumor angesehen werden. Eine abnorme Östrogenaktivität ist als Risikofaktor für die Entstehung eines Ovarialkarzioms beschrieben. Die pleiotropen Effekte des Östrogens werden über ERα und ERβ Östrogenrezeptoren moduliert. Die Expression dieser Östrogenrezeptoren zeigte in mehreren Untersuchungen jedoch nur eine untergeordnete Bedeutung für die Prognose beim Ovarialkarzinom. Desweiteren sind nur niedrige Ansprechraten für antihormonelle Therapien beim Ovarialkarzinom beschrieben. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Unterfamilie von sog. Orphan -Rezeptoren, d.h. Östrogenrezeptor-assoziierten Rezeptoren (estrogen receptor-related receptors, ERRs) die Transkription einzelner Östrogen sensibler Gene über Varianten der estrogen-responsive elements (EREs) moduliert. Ziel der vorliegenden Studie ist es, den Zusammenhang zwischen der Familie der Orphan -Rezeptoren (ERRα, ERRβ, ERRγ), deren isoformen Transkriktionsprodukten (hERRα-1, hERRβ-2) und der klinisch-histopathologischen Faktoren des Ovarialkarzinoms zu untersuchen, da hierzu bisher nur marginale Daten existieren. Methoden: Für den Nachweis der subzellulären Lokalisation der ERRs wurde ein spezielles Plasmid (hERRα-GFP) synthetisiert und in Ovarialkarzinom-Zelllinien (SKOV-3 und OVCAR-3) transfiziert. Der Nachweis der Expression des hERRα-GFP Fusionsproteins auf dem Zellnukleus erfolgte mittels eines zweifarbigen konfokalen Scanmikroskops. Nach Transfektion mit dem HA-tag-hERRγ-Plasmid wurde ein HA-hERRγ Fusionsprotein in der Nuklear-Proteinextraktion der Ovarialkarzinom-Zelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und ES-2 mittels Western-Blot Analyse nachgewiesen. Die Analyse der Protein- und mRNA-Expression von ERR Isoformen erfolgte an 5 Ovarialkarzinom-Zelllinien, 33 primären Ovarialkarzinomen und 12 Normalgeweben des Ovars mittels Immunhistochemie und Light-cycle RT-PCR. Ergebnisse: Bei Ovarialkarzinomen zeigten 57,6% (19) eine hERRα-Expression, 3 (9,1%) eine hERRβ-Expression und 48,5% (16) eine hERRγ-Expression. Bei den Normalgeweben des Ovars wurde folgerd Verteilung beobachtet: 16,7% (2), 0% (0) und 33,3% (4). Diese Unterschiede war statistisch signifikant: hERRα (p=0,02) und hERRγ (p=0,045). Weiterhin zeigte sich eine hohe Koexpression von hERα und hERRα in den Ovarialkarzinomen. Hierbei war eine erhöhte Expression von hERRα mit einer niedrigen Expression von hERα assoziiert. In den Normalgeweben des Ovars war die hERα/hERRα Rate höher im Vergleich zu den Ovarialkarzinomen. Um die potentielle Rolle der ERRs als Biomarker für das Ovarialkarzinom weiter zu untersuchen, wurden Korrelationsanalysen zwischen der Expression der ERRs und dem Tumormarker CA-125 und klinisch-histopathologischen Faktoren und dem Überleben durchgeführt. Die CA-125 Konzentration wurde mittels ELISA bestimmt. Der mediane CA-125 Gehalt in der Gruppe der Ovarialkarzinome mit positiver hERRα Expression war signifikant erhöht im Vergleich zur Gruppe der Ovarialkarzinome, die hERRα nicht exprimierten (p=0,012). Die Expression von hERRβ bzw. hERRγ zeigten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem CA-125 Level (p=0,795 bzw. 0,515). Weiterhin fand sich eine signifikante Korrelation zwischen der Expression von hERRα und dem Tumormarker CA-125 (p=0,012). Das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben wurden mittels der Kaplan-Meier Methode bestimmt. Die Expression von hERRα zeigte in der multivariaten Analyse eine unabhängige prognostische Signifikanz für das Überleben (RR: 3,032; 95% KI: 1,27-6,06). Ausserdem korrelierte eine erhöhte Expression von hERRα mit einem erhöhten CA-125 Level, einem fortgeschritteneren FIGO-Tumorstadium, schlecht differenzierten Ovarialkarzinomen und einer kürzeren Gesamtüberlebenszeit. Die erhöhte Expression von hERRγ korrelierte signifikant mit einem früheren FIGO- Tumorstadium (p=0,040) und längerem progressionsfreien Überleben (p=0,020). Zudem zeigte sich ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Expression von hERRγ und niedrigeren CA-125 Levels sowie einer geringeren intraoperativen Aszitesmenge. Die Überlebensanalysen zeigten ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben in der Gruppe der hERRα-positiven Ovarialkarzinome (p=0,015) und ein signifikant längeres progressionsfreies Überleben in der Gruppe der hERRγ-positiven Ovarialkarzinome (p=0,020). Schlussfolgerzungen: Die Expression von ERRs ist hauptsächlich im Zellnukleus nachzuweisen. Die Orphan Rezeptoren hERRα und hERRγ scheinen eine relevante Rolle in der Tumorogenese des Ovarialkarzinoms zu spielen, so ist eine erhöhte Expression von hERRα mit forgeschritteneren Tumorstadien sowie einem agressiveren malignem Potential assoziiert. ERRα und ERRγ können somit potentielle therapeutische Targets für das Ovarialkarzinom dar stellen.