Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) lokalisieren in einer komplex- zusammengesetzten Mikroumgebung, die essentiell für die HSC-Regulation ist. Bei einer akuten myeloischen Leukämie (AML) resultiert aus einer klonalen Transformation eine Expansion maligner Progenitorzellen, die das Knochenmark infiltrieren und mit mesenchymalen Stromazellen (BM-MSC) der Mikroumgebung interagieren. Zahlreiche Studien untersuchten Aberrationen in AML-Zellen, während molekulare Alterationen in BM-MSC von AML-Patienten (AML BM-MSC) und deren putativ pathophysiologische Rolle weitestgehend unergründet blieben. Um molekulare Alteration der AML-Mikroumgebung zu untersuchen, wurden AML BM-MSC zu verschiedenen Zeitpunkten des AML-Krankheitsverlaufs isoliert und in vitro expandiert. AML BM-MSC wurden auf genetischer, transkriptioneller und epigenetischer (DNA-Methylierung) Ebene mittels Hochdurchsatzplattformen (Illumina und Affymetrix) untersucht und mit Kontrollen gesunder Spender (GS BM-MSC) verglichen. Die Gesamtexomsequenzierung der AML BM-MSC von 21 Patienten zeigte ein unspezifisches Muster genetischer Alterationen. In AML BM-MSC wurden, verglichen mit GS BM-MSC, mehr Mutationen identifiziert. Hingegen trugen AML BM-MSC eine geringere Mutationslast als die korrespondierenden hämatopoetischen Zellen. Die aberranten Genexpressions- und DNA-Methylierungsmuster der AML BM-MSC zeigten eine signifikante Anreicherung zellulärer Komponenten mit einer Implikation in der Stroma-Leukämie- Interaktion: Chemokine, Zelladhäsionsmoleküle und Proteoglycane. Beide molekulare Ebenen, die globale Genexpression und die DNA-Methylierung der AML BM-MSC, spiegelten eine Deregulierung zellulärer Prozesse der Endozytose und des Metabolismus wider. Die generierten Genexpressions- und DNA- Methylierungssignaturen zeigten zudem deutlichere Aberrationen im Kontrast zu GS BM-MSC als im Vergleich zwischen Verlaufsproben von Patienten in der AML- Progression. Eine überexprimierte Komponente der AML-Mikroumgebung, welche aus den transkriptionellen Profilen hervorging, war das Proteoglycan Lumican. Eine stabile Überexpression von Lumican alterierte die Proliferation und Morphologie der Stromazelllinie HS-5, hatte hingegen keinen Einfluss auf die Apoptoserate in HS-5 Zellen. Weiterhin wurden der Immunophänotyp (CD33-CD45-CD73+CD105+CD271+/-) sowie die Proliferationskapazitäten der frühen Passagen der AML BM-MSC in vitro Kultur untersucht. Eine CD271+ Population war hierbei hochvariabel (0-81 % der Gesamtpopulationen). AML BM-MSC zeigten gegenüber GS BM-MSC keine signifikant verschiedenen in vitro-Expansionszeiten. Die vorliegende Arbeit präsentiert eine umfassende Analyse genetischer, transkriptioneller und epigenetischer Alterationen in AML BM-MSC. Die aberranten molekularen Signaturen der AML BM-MSC zeichnen das Bild einer global alterierten AML-Mikroumgebung und bieten eine Plattform für die Identifizierung neuer putativer Zielmoleküle für nischenspezifische Therapieansätze.
Hematopoeitic stem cells (HSCs) are sheltered in the bone marrow (BM) microenvironment, a multicellular compartment containing mesenchymal stromal cells (BM-MSC), which are essential for HSC repopulation and differentiation. In acute myeloid leukemia (AML), a clonal transformation event gives rise to the accumulation of malignant myeloid progenitors that infiltrate the bone marrow cavity and interact with BM-MSC. Numerous studies have focused on molecular aberrations of AML cells, while molecular alterations in BM-MSC derived from AML patients (AML BM-MSC) and their putative pathophysiological role in leukemogenesis remain elusive. In order to unravel molecular alterations in the AML microenvironment, AML BM-MSC were isolated and expanded in vitro from different time points of disease progression. In addition, healthy donor controls (HD BM-MSC) were obtained. Both AML BM-MSC and HD BM- MSC were molecularly profiled on genetic, transcriptional, and epigenetic (DNA methylation) levels using Illumina and Affymetrix high throughput platforms. Whole exome sequencing of AML BM-MSC of 21 patients revealed a nonspecific mutational pattern and a higher frequency of genetic lesions in AML BM-MSC than in HD BM-MSC. Moreover, AML BM-MSC exhibited less genetic lesions than the hematopoietic counterparts (AML cells). Aberrant transcriptional patterns of AML BM-MSC were enriched in putative stroma-leukemia interaction molecules: chemokines, adhesion molecules and proteoglycans. Both molecular levels, aberrant gene expression and DNA methylation, were enriched in genes associated with endocytosis and metabolic pathways indicating an imbalance of these processes in the AML microenvironment. Compared to patient-matched serial AML BM-MSC samples in the course of the disease, AML BM-MSC showed the most significant changes in contrast to HD BM-MSC. Proteoglycan Lumican, a putative target with significant overexpression in AML BM-MSC transcriptional profiles, was chosen for further investigations. Lumican overexpression impaired the proliferation and altered the morphology of stromal cell line HS-5 but did not influence the apoptotic rate in HS-5 cells. Furthermore, AML BM-MSC were characterized with regard to immunophenotype (CD33-CD45-CD73+CD105+CD271+/-) and to expansion capacities of the early in vitro culture. A CD271+ population was highly variable (0-81 % of total cell population). AML BM-MSC showed similar expansion times compared to HD BM-MSC. The thesis provides a comprehensive analysis of genetic, transcriptional, and DNA methylation alterations in AML BM-MSC. Furthermore, this approach provides a platform for the identification of putative targets for future niche directed therapies.
