Three synthetic peptides corresponding to epitopes from outer membrane and secreted proteins from Neisseria meningitidis were synthesized by solid-state Fmoc chemistry. The peptides were a 20-mer from the Opc invasin, as well as a 20- and 50-mer of IgA1-protease.
The peptides were coupled to bovine serum albumin, ovalbumin, keyhole limpet hemocyanin, thyroglobulin and tetanus toxoid via a C- or N-terminal cysteine. Aminooxyacetyl derivatives were condensed on a synthetic ring template to yield tetra-oximes. The peptides were also incorporated into liposomes and the 20-mers were synthesized in the form of tetra-lysine multiple antigenic peptides (MAPs).
Immunogen synthesis was paralleled by the molecular characterization of the various constructs employing mass spectrometry, amino acid analysis and chromatographic methods.
Balb/c mice were immunized 3 times with normalized formulations of all of these constructs, as well as with free peptides or with peptides in the presence of cytokines IL-4 and GM-CSF.
Immunogenicity was evaluated by sub-class-specific ELISPOT analysis and by ELISA. The results show dramatic differences in immunogenicity, depending on the immunogen type:
The tested protein carriers confirmed their standing as a general, straightforward and reliable approach for increasing immunogenicity of synthetic peptide antigens. As little as 200 pmol antigenic peptide and 2.2 m g protein carrier per injection efficiently induced an immune response.
The protein carriers were not equally immunogenic. KLH, thyroglobulin and tetanus toxoid demonstrated superior immunogenicity over BSA and ovalbumin. High molecular weight of a protein carrier resulting in high peptide to carrier coupling ratios appear to be beneficial for immunogenicity.
As demonstrated for an ovalbumin carrier conjugate, a molar coupling ratio of 1.4 sufficed for efficiently stimulating a murine immune response, i.e. a minimum representation of one antigenic peptide ligand per carrier molecule proved to be immunogenic.
The results also reflected an antigen/carrier interdependence, i.e. conjugate immunogenicity depends both on the carrier and on the peptide antigen. None of the protein carriers excelled as a standard approach.
Non-protein formulations (free peptides, liposomes, MAPs and tetra-oximes) required the peptide ligand to be itself immunogenic in order to obtain immunostimulatory potency: Among the three synthetic peptides investigated, only the 50 aa peptide of IgA1-protease (IgA1-PA50) induced elevated IgG serum titers if administered as free peptide and only that peptide showed increased immunogenicity upon integration into liposomes and tetra-oximes thereafter: The tetra-oxime type 25 kDa "synthetic protein" of peptide IgA1-PA50 was comparable to BSA and ovalbumin protein conjugates concerning immunostimulatory potency. Structural analysis of IgA1-PA50 revealed the presence of high proportions of stable, ordered structure for this particular peptide. Moreover, the observed IgG class-switch in IgA1-PA50 peptide immunization is indicative for the presence of at least one T cell epitope on the 50-mer. By T cell epitope mapping, human but not known murine T cell epitopes could be identified.
Two recombinant murine cytokines which were tested as adjuvants, Interleukin-4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), had only minor effects on peptide antigen immunogenicity.
Im Rahmen dieser Studie wurden 3 Epitope aus Pathogenitätsfaktoren von Neisseria meningitidis als synthetische Peptid-Antigene dargestellt und die Wirksamkeit verschiedener Trägerstrukturen ("Carrier") bzw. Immunogen- Formulierungen für die immunostimulatorsche Potenz dieser Peptide vergleichend untersucht.
Die Peptidantigene, ein 20 Aminosäuren langes Motiv aus Opc Invasin, sowie ein 20- und ein 50-mer aus Serogruppe C bzw. Serogruppe A IgA1-Protease, wurden durch Festphasen-Peptidsynthese erzeugt. C- bzw. N-terminal Cystein- modifizierte Peptide wurden an die Protein-Carrier Bovines Serumalbumin, Ovalbumin, Keyhole Limpet Hämocyanin, Thyroglobulin und Tetanus Toxoid gekoppelt. Aminooxyacetyl-Derivate der Peptide wurden mit Hilfe ringförmiger aktivierter "Templates" zu Tetra-Oximen kondensiert. Als Trägerstruktur kamen ferner Liposomen zum Einsatz und die beiden 20-mere wurden als "Multiple Antigenic Peptides" (MAPS) dargestellt.
Die Synthese dieser Peptid-Immunogene wurde durch ihre molekulare Charakterisierung begleitet. Hierbei wurden Massenspektrometrie, Amino Acid Analysis (AAA) und chromatografische Methoden herangezogen. Die Sekundärstruktur des 50-mers wurde zudem mittels Circular Dichroism (CD) analysiert.
Die Immunogenität der verschiedenen Peptid-Formulierungen wurde im Balb/c Maus-Modell evaluiert. In drei ausgewählten Formulierungen wurden darüber hinaus die Cytokine IL-4 und GM-CSF als Adjuvantien getestet.
Die murine Immunantwort wurde durch die Messung zweier immunologischer Parameter erfaßt: i) Subklassen-spezifische Konzentration der Serum-Antikörper (ELISA) und, auf zellulärer Ebene, ii) Stimulation von B-Lymphozyten in der Milz (ELISPOT). Abhängig von der Art der Immunogen-Formulierung wurden dabei erhebliche Unterschiedene in der Immunogenität der verschiedenen Peptid- Immunogene beobachtet.
Die getesteten Protein-Carrier untermauerten ihren Ruf als unkomplizierte und verläßliche Methode zur Steigerung der Immunogenität synthetischer Peptide. Peptid/Protein-Konjugate erwiesen sich in den verwendeten niedrigen Dosierungen von 200 pmol Peptid bzw. ab 2.2 m g Konjugat pro Injektion als durchweg immunogen. Bereits eine statistische Kopplungsrate von 1,4 Peptiden pro Carrier-Molekül zeigte eine starke immunostimulatorische Wirkung, wie an einem Ovalbumin-Konjugat gezeigt werden konnte. Allerdings wiesen die Protein- Carrier Unterschiede in ihrer immunostimulatorischen Potenz auf. Zudem offenbarten die untersuchten Peptid-Antigene unterschiedliche Carrier- Präferenzen. Bedingt durch diese kontextabhängige Immunogenität empfahl sich keiner der untersuchten Protein-Carrier als "Methode der Wahl".
Der Einsatz Protein-freier Carrier (Liposomen, MAPs, Tetra-Oxime) führte nur dann zu einer Verstärkung der immunostimulatorischen Potenz des Peptid- Antigens, wenn das Peptid bereits per se immunogen war. Im Falle des 50 aa langen Peptides IgA1-PA50, das bereits als freies Peptid eine starke IgG- Antwort stimulierte, bewirkte der Einsatz von Liposomen und Tetra-Oximen eine deutliche Immunogenitätssteigerung. Dabei erzielte in Form synthetischer Tetra-Oxime verabreichtes 50-mer eine mit Ovalbumin- und BSA-Konjugaten vergleichbare immunostimulatorische Wirkung. Der auffallenden intrinsischen Immunogenität des 50 aa Peptids wurde mit Strukturaufklärung und einem "T cell epitope mapping" nachgegangen.
