Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine objektive Methodik für die Früherkennung des Zervixkarzinoms zu entwickeln und klinisch zu validieren. Dabei wurden diagnostische und prognostische Ansätze mit Real-Time PCR verfolgt. Es konnten basierend auf verschiedenen viralen und humanen Genen zwei mRNA basierte diagnostische Tests entwickelt werden, die gegenüber der herkömmlichen Zytologie deutlich spezifischer und sensitiver den Krankheitsstatus anzeigen. Dabei wurden bei der klinischen Validierung Grundlagendaten zur altersbedingten Regulation der zellzyklussteuernden Proteine P14ARF und P16INK4A gewonnen die von hoher Relevanz in der Zervixdiagnostik sind. Für die Identifikation prognostischer Marker wurde eine Real-Time PCR basierte high-thoughput Plattform für die klinische Validierung von Single Nucleotide Polymorphismen in der Zervixdiagnostik aufgebaut. Mit dieser Plattform wurden vier SNPs anhand des Patientenmaterials von 749 Frauen validiert. Dabei wurde eine sehr seltene Genmutation des zell- detoxifizierenden Proteins CYP1A1 identifiziert, die ein fast neunfach höheres Risiko vermittelt. Dasselbe Verfahren konnte abgewandelt auch auf Gendeletionen angewendet werden. Bei der Validierung der Gendeletionen GSTM1 und GSTT1 konnten signifikante Gen-Umweltinteraktionen über Multiplex-PCRs durch anschließende Schmelzkurvenauslesung nachgewiesen werden. Aus diesen Schmelzkurvendaten konnte zusätzlich eine Methode entwickelt werden, welche theoretisch die Evaluierung und ggf. Korrektur von HRM-Analysen (High Resolution Melting Curve –Analysen) erlaubt. Die effiziente HRM-basierte Auslesung von SNPs oder Methylierungs-ereignissen hat große Vorteile, setzt aber eine tadellose Gerätegenauigkeit voraus. Mit unserer neu entwickelten Methode wurde zum ersten Mal eine lückenlose und umfangreiche Gerätetemperaturüberprüfung unter Realbedingungen entwickelt. Darüber hinaus ist diese Kontrolle in behördlich regulierten Diagnostiklaboren von großem Interesse.
The aim of this study was to evaluate different diagnostic and prognostic biomarkers with respect to their feasibility in cervical cancer diagnosis using real-time PCR protocols. First we analysed different mRNA based diagnostic markers in a standard clinical setting. Particularly we explored the transcripts p14ARF and p16INK4A regarding to their usability in cancer screening. Higher levels of these mRNAs may indicate HPV type-independently the up regulation of E6 and E7 oncogene expression that in turn indicates malignant transformation. Additionally we analysed the influence of age on the expression of p14ARF and p16INK4A. The p14ARF and p16INK4A expression levels relative to the housekeeping gene ACTB were significantly up- regulated in HSIL patients. A significant age-related bias was observed. Our results support wariness in interpretation of p14ARF and p16INK4A mRNA expression results from older patients. Additionally, we analysed different single nucleotide polymorphisms (SNPs) regarding to their prognostic usability because genetic epidemiological studies showed that SNPs contribute to disease risk. We developed a platform procedure to analyse such genetic risk factors retrospectively using patient material that accumulates in many gynecologic laboratories. We applied a new approach that is inferencing by semantic integration the different clinical diagnoses and is assigning a severity index for each patient. Also a multiplex ligation-dependent polymerase chain reaction approach was designed for SNP analysis using low-input concentration genomic DNA. We have chosen a set of SNPs in genes that are involved in deregulation of cell cycle proteins, genetic repair mechanisms, and cell detoxification because they may contribute to disease progression. This study revealed genetic associations of a rare SNP genotype with cervical dysplasia in one of the largest patient sample to date and warrants further investigation. The severity index data were also used to analyse the effect of deletions in glutathion-S transferases. Here we applied a multiplex PCR assay with melting curve read out and particularly analysed for gene–environment interactions. From these melting curve data we could derive a method for temperature validation of real-time PCR instruments. By ap¬plying high- resolution melting (HRM) analysis using a defined PCR amplicon and EvaGreen dye, information about the temperature accuracy and thermal homogeneity of the heating block was obtained. The advantages of this HRM-based method include i) temperature measurement under real world conditions in the reaction liquid in closed reaction tubes; ii) temperature measurement of all wells; iii) and applica¬bility to all real-time PCR instruments capable of HRM analysis.
