dc.contributor.author
Keyserling, Helmut Graf von
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:21:29Z
dc.date.available
2012-12-05T10:44:08.801Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7782
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11981
dc.description.abstract
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine objektive Methodik für die
Früherkennung des Zervixkarzinoms zu entwickeln und klinisch zu validieren.
Dabei wurden diagnostische und prognostische Ansätze mit Real-Time PCR
verfolgt. Es konnten basierend auf verschiedenen viralen und humanen Genen
zwei mRNA basierte diagnostische Tests entwickelt werden, die gegenüber der
herkömmlichen Zytologie deutlich spezifischer und sensitiver den
Krankheitsstatus anzeigen. Dabei wurden bei der klinischen Validierung
Grundlagendaten zur altersbedingten Regulation der zellzyklussteuernden
Proteine P14ARF und P16INK4A gewonnen die von hoher Relevanz in der
Zervixdiagnostik sind. Für die Identifikation prognostischer Marker wurde eine
Real-Time PCR basierte high-thoughput Plattform für die klinische Validierung
von Single Nucleotide Polymorphismen in der Zervixdiagnostik aufgebaut. Mit
dieser Plattform wurden vier SNPs anhand des Patientenmaterials von 749 Frauen
validiert. Dabei wurde eine sehr seltene Genmutation des zell-
detoxifizierenden Proteins CYP1A1 identifiziert, die ein fast neunfach höheres
Risiko vermittelt. Dasselbe Verfahren konnte abgewandelt auch auf
Gendeletionen angewendet werden. Bei der Validierung der Gendeletionen GSTM1
und GSTT1 konnten signifikante Gen-Umweltinteraktionen über Multiplex-PCRs
durch anschließende Schmelzkurvenauslesung nachgewiesen werden. Aus diesen
Schmelzkurvendaten konnte zusätzlich eine Methode entwickelt werden, welche
theoretisch die Evaluierung und ggf. Korrektur von HRM-Analysen (High
Resolution Melting Curve –Analysen) erlaubt. Die effiziente HRM-basierte
Auslesung von SNPs oder Methylierungs-ereignissen hat große Vorteile, setzt
aber eine tadellose Gerätegenauigkeit voraus. Mit unserer neu entwickelten
Methode wurde zum ersten Mal eine lückenlose und umfangreiche
Gerätetemperaturüberprüfung unter Realbedingungen entwickelt. Darüber hinaus
ist diese Kontrolle in behördlich regulierten Diagnostiklaboren von großem
Interesse.
de
dc.description.abstract
The aim of this study was to evaluate different diagnostic and prognostic
biomarkers with respect to their feasibility in cervical cancer diagnosis
using real-time PCR protocols. First we analysed different mRNA based
diagnostic markers in a standard clinical setting. Particularly we explored
the transcripts p14ARF and p16INK4A regarding to their usability in cancer
screening. Higher levels of these mRNAs may indicate HPV type-independently
the up regulation of E6 and E7 oncogene expression that in turn indicates
malignant transformation. Additionally we analysed the influence of age on the
expression of p14ARF and p16INK4A. The p14ARF and p16INK4A expression levels
relative to the housekeeping gene ACTB were significantly up- regulated in
HSIL patients. A significant age-related bias was observed. Our results
support wariness in interpretation of p14ARF and p16INK4A mRNA expression
results from older patients. Additionally, we analysed different single
nucleotide polymorphisms (SNPs) regarding to their prognostic usability
because genetic epidemiological studies showed that SNPs contribute to disease
risk. We developed a platform procedure to analyse such genetic risk factors
retrospectively using patient material that accumulates in many gynecologic
laboratories. We applied a new approach that is inferencing by semantic
integration the different clinical diagnoses and is assigning a severity index
for each patient. Also a multiplex ligation-dependent polymerase chain
reaction approach was designed for SNP analysis using low-input concentration
genomic DNA. We have chosen a set of SNPs in genes that are involved in
deregulation of cell cycle proteins, genetic repair mechanisms, and cell
detoxification because they may contribute to disease progression. This study
revealed genetic associations of a rare SNP genotype with cervical dysplasia
in one of the largest patient sample to date and warrants further
investigation. The severity index data were also used to analyse the effect of
deletions in glutathion-S transferases. Here we applied a multiplex PCR assay
with melting curve read out and particularly analysed for gene–environment
interactions. From these melting curve data we could derive a method for
temperature validation of real-time PCR instruments. By ap¬plying high-
resolution melting (HRM) analysis using a defined PCR amplicon and EvaGreen
dye, information about the temperature accuracy and thermal homogeneity of the
heating block was obtained. The advantages of this HRM-based method include i)
temperature measurement under real world conditions in the reaction liquid in
closed reaction tubes; ii) temperature measurement of all wells; iii) and
applica¬bility to all real-time PCR instruments capable of HRM analysis.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
cervical cancer
dc.subject
"real-time PCR"
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Real-Time PCR basierte diagnostische und prognostische Assays zur
Früherkennung des Zervixkarzinoms
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Andreas M. Kaufmann
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Ingeborg Zehbe
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Peter Öhlschläger
dc.date.accepted
2012-10-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000040170-1
dc.title.translated
Real time PCR-based diagnostic and prognostic assays for the early detection
of cervical cancer
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000040170
refubium.note.author
Kumulative Promotion
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012579
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access