Reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) is widely used in microRNA (miRNA) expression studies on cancer. To compensate for the analytical variability produced by the multiple steps of the method, relative quantification of the measured miRNAs is required, which is based on normalization to endogenous reference genes. No study has been performed so far on reference miRNAs for normalization of miRNA expression in urothelial carcinoma. The aim of this study was to identify suitable reference miRNAs for miRNA expression studies by RT-qPCR in urothelial carcinoma. Methods: Candidate reference miRNAs were selected from 24 urothelial carcinoma and normal bladder tissue samples by miRNA microarrays. The usefulness of these candidate reference miRNAs together with the commonly for normalization purposes used small nuclear RNAs RNU6B, RNU48, and Z30 were thereafter validated by RT-qPCR in 58 tissue samples and analyzed by the algorithms geNorm, NormFinder, and BestKeeper. Principal Findings: Based on the miRNA microarray data, a total of 16 miRNAs were identified as putative reference genes. After validation by RT-qPCR, miR-101, miR-125a-5p, miR-148b, miR-151-5p, miR-181a, miR-181b, miR-29c, miR-324-3p, miR-424, miR-874, RNU6B, RNU48, and Z30 were used for geNorm, NormFinder, and BestKeeper analyses that gave different combinations of recommended reference genes for normalization. Conclusions: The present study provided the first systematic analysis for identifying suitable reference miRNAs for miRNA expression studies of urothelial carcinoma by RT-qPCR. Different combinations of reference genes resulted in reliable expression data for both strongly and less strongly altered miRNAs. Notably, RNU6B, which is the most frequently used reference gene for miRNA studies, gave inaccurate normalization. The combination of four (miR-101, miR-125a-5p, miR-148b, and miR-151-5p) or three (miR-148b, miR-181b, and miR-874,) reference miRNAs is recommended for normalization.
Die quantitative reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) ist eine häufig verwendete Methode zur Untersuchung von microRNA(miRNA)-Expressionen bei Tumorerkrankungen. Die relative Quantifizierung der gemessenen miRNAs, basierend auf endogenen Referenzgenen, ist dabei unerlässlich, um die Variabilität, bedingt durch die einzelnen Teilschritte der Analyse, zu kompensieren. Eine Literaturrecherche ergab, dass bis zum jetzigen Zeitpunkt keine Studien zur Ermittlung von Referenz-miRNAs für das Harnblasenkarzinom vorliegen. Das Ziel dieser Studie war es, in systematischer Weise geeignete Referenz-miRNAs für RT-qPCR basierte miRNA- Expressionsstudien des Harnblasenkarzinoms zu identifizieren. Methodik: Unter Zuhilfenahme eines miRNA-Microarrays wurden aus insgesamt 24 Karzinom- und Normalgewebeproben der Harnblase Kandidaten von Referenz-miRNAs anhand ihrer Invarianz in der Expressionsstabilität zwischen den Proben ermittelt. Die Validierung dieser potenziellen Referenz-miRNAs erfolgte zusammen mit den häufig in der Literatur verwendeten small RNAs, RNU6B, RNU48 und Z30, an 58 Gewebeproben mittels RTqPCR. Die anschließende bioinformatorische Analyse wurde mit den Computerprogrammen geNorm, NormFinder und BestKeeper durchgeführt. Grundlegende Ergebnisse: Insgesamt wurden 16 potenzielle Referenz-miRNAs auf der Grundlage der miRNAMicroarraydaten identifiziert. Nach der Validierung mittels RT-qPCR zeigten miR-101, miR-125a-5p, miR-148b, miR-151-5p, miR-181a, miR-181b, miR-29c, miR-324-3p, miR- 424, miR-874, RNU6B, RNU48 und Z30 keine Unterschiede zwischen den Gewebeproben, sodass ihre Eignung als Referenzgene mit den drei Programmen ermittelt werden konnte. Daraus resultierten unterschiedliche Referenzgenkombinationen. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Studie lieferte die erste systematische Analyse zur Identifizierung geeigneter Referenz-miRNAs für miRNA- Expressionsstudien des Harnblasenkarzinoms mittels RT-qPCR. Verschiedene Referenzgenkombinationen ergaben sowohl für starkals auch für schwach- regulierte miRNAs vergleichbare Expressionsergebnisse. Besonders eindrucksvoll konnte die fehlerhafte Normalisierung mit der RNU6B belegt werden, die bisher am häufigsten in miRNA-Studien als Referenzgen zum Einsatz kam. Die Kombination aus vier (miR-101, miR-125a-5p, miR-148b und miR-151-5p) bzw. aus drei (miR-148b, miR-181b und miR-874) Referenz-miRNAs wird für die Normalisierung von Expressionsstudien beim Harnblasenkarzinom empfohlen.