Der TSHR ist ein Vertreter der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Er wird hauptsächlich in der basolateralen Membran der Follikelepithelzellen der Schilddrüse exprimiert und ist an der Regulation vieler metabolischer Prozesse des Körpers beteiligt. Angeborene und erworbene Mutationen des TSHR haben oft eine Hypothyreose bzw. Hyperthyreose zur Folge. Morbus Basedow ist TSHR- abhängige Autoimmunerkrankung. Eine besondere Form des Morbus Basedow stellt die Endokrinen Orbithopathie (EO) dar. Die Stimulation des TSHR durch die Autoantikörper führt bei EO zu einer verstärkten Zellproliferation und Zellausdifferenzierung zu Adipozyten. Diese Prozesse haben eine Volumenzunahme des orbitalen Bindegewebes und einen Exophtalmus zur Folge. Die bislang eingesetzten Medikamente bei Morbus Basedow unterbinden die Synthese der Schilddrüsenhormone und haben daher keinen Einfluss auf den Verlauf der EO. Die Identifizierung kleiner Moleküle, die direkt am TSHR wirken, ist daher von besonderer Bedeutung. Die Bindungstasche kleiner Moleküle vieler GPCR befindet sich innerhalb des transmembranären Bereiches und wird durch Aminosäuren der angrenzenden Helizes ausgekleidet. Die Optimierung der kleinen Moleküle in ihrer Wirkung setzt die Kenntnis über deren räumliche Orientierung im Rezeptor und damit die der funktionalen Gruppen der umgebenden Aminosäuren voraus. Für die transmembranäre Domäne des TSHR gibt es momentan noch keine Kristallstruktur. Der erste Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag daher darauf, den Einfluss der Position 5935.50 auf die Konformation der transmembranären Helix (TMH) 5 zu untersuchen. Im Detail sollte die Orientierung der Aminosäuren an der TMH5 geklärt werden. Hierfür wurden TSHR- Mutanten generiert und funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen auf eine reguläre α-helikale Struktur der TMH5 im TSHR schließen. Die gewonnenen Daten über die strukturelle Konformation der TMH5 wurden für die Optimierung des TSHR-Homologiemodells genutzt, welches für die Docking-Studien kleiner Liganden von besonderer Bedeutung ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte ein zellbasiertes High Throughput Screening (HTS) zur Identifizierung von TSHR-Antagonisten etabliert und erfolgreich durchgeführt werden. Die Auswertung des primären HTS und die anschließende Bestimmung der konzentrations-abhängigen Inhibierung des Rezeptors durch die Substanzen, der Ausschluss falsch positiver Hits und sowie die Verifizierung der Substanzen sekundärem Screening in HEK293T-TSHR-Zellen führte zu drei Substanzen. Als Resultat konnte ein an dem TSHR selektiv wirkender Antagonist, die Substanz S37, identifiziert werden. Die anschließende pharmakologische Charakterisierung ergab, dass S37 selektiv in einer konzentrationsabhängigen Weise auf den TSHR wirkt und keine zytotoxische Aktivität zeigt. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit erfolgreich Sequenz-Struktur- Funktions-analysen zur Klärung der TMH5-Konformation im TSHR und ein HTS zur Identifizierung von TSHR-Antagonisten durchgeführt. Im Zuge dessen konnte eine Substanz mit selektivem antagonistischem Effekt auf den TSHR als Grundlage für weitere Optimierungen identifiziert werden.
The TSHR is a G-protein-coupled receptor (GPCR) and belongs to the subclass of glycoprotein hormone receptors. It is involved in the regulation of many metabolic processes in the human body. Receptor activation by its endogenous ligand – the thyroid-stimulating hormone (TSH, thyrotropin) – leads to production of second messengers such as cAMP or IP3. These in turn regulate the iodine uptake, thyroglobulin synthesis, endocytosis and proteolysis, peroxidase activity, iodination and hormone secretion. TSHR is mainly expressed in follicular epithelial cells of the thyroid gland. The receptor expression has also been detected in non-thyroid tissue, such as orbital fibroblasts (OF), bones, gonads and kidneys. Congenital and somatic mutations of the TSHR often cause hypothyroidism or hyperthyroidism. Uncontrolled receptor activation by autoantibodies directed against the TSHR results in an autoimmune disorder known as Graves’ disease. Thyroid-associated endocrine orbitopathy is one of the most typical symptoms of Graves’ disease. This ocular manifestation includes tissue inflammation, proptosis, corneal exposure and optic nerve compression. TSHR activation by autoantibodies is considered as a key process of EO and leads to cell proliferation and cell differentiation. The current therapy for Graves’ disease is confined to restricting the synthesis of thyroid hormones and thus has no effect on the course of EO. At the moment, there are no drugs available on the market that target the TSHR directly. The direct suppression of the pathological TSHR activation by low molecular weight (LMW) molecules could be a potential approach for treating Graves’ disease or EO. The first aim of this thesis was to prove if transmembrane helix 5 (TMH5) of the TSHR exhibits a conformation different from that found in most other family-A GPCRs. The biochemical and structural characterization of TSHR mutants was utilized to clarify the conformation of TMH5. Within family-A GPCRs, a highly conserved proline can be found at position 5.50 in TMH5 which causes a twist in the helix structure. In contrast, all glycoprotein hormone receptors have an alanine at this position. The influence of the position 5935.50 on the conformation of TMH5 and thus also on ligand-binding was to be examined in detail. To gain insights into the functionality of this position, alanine was exchanged with proline, glycine and valine using site-directed mutagenesis. The generated TSHR mutants were characterized in terms of cell-surface expression and basal and thyrotropin- induced cAMP accumulation. The functional data of the mutants show changes either in cell-surface expression, in signaling or both. Based on this functional data, the conclusion was drawn that TSHR might have a different conformation from most other family-A GPCRs by a regular α-helix. Consequently, the lack of the proline at position 5.50 in the TSHR leads to a shift of amino acids by one position. In turn, this results in a different orientation of the amino acids in the N-terminal region of the TMH5, and also within the transmembrane binding pocket. The obtained data explained previously reported mutational effects in this region and were used for the optimization of the TSHR homology model, which is of particular importance for docking studies of small ligands. The second part of the thesis focuses on the establishment and implementation of a cell-based HTS assay to identify a lead structure that provides starting points for the development of a selective antagonist for the TSHR. The completion of the primary screen of 16000 compounds performed in the CHO-K1-TSHR cell line resulted in 350 positive hits. The determination of the dose-dependent inhibition of these compounds, together with the exclusion of false positive hits through testing them in the CHO-K1 cell line without TSHR, led to the identification of 12 compounds. The verification of these 12 compounds was performed in a secondary screen using a HEK293T-TSHR cell line, ultimately leading to the identification of three compounds with antagonistic activity towards the TSHR. Two compounds, S4 and S9, were selected and formed the basis for further structure-function analysis. The experimental testing of 24 derivatives led to the identification of compound S37, a selective TSHR antagonist. S37 is a product of a stereoselective synthesis from compound S4 and is a stereoisomer in endo- conformation. The pharmacological characterization revealed that substance S37 is not toxic in a HEK293T-TSHR cell line and inhibits TSHR activation in a dose-dependent manner. The special advantage of substance S37 is that it is strictly TSHR-selective and has no effects on the homologous receptors LHCGR and FSHR. In summary, sequence-structure-function analysis to clarify the TMH5 conformation of the TSHR as well as a HTS for TSHR antagonists were successfully performed in the course of this thesis´ work. The latter resulted in the identification of a compound with selective TSHR antagonistic effect that represents a base for further optimization.
