dc.contributor.author
Hoyer, Inna
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:16:24Z
dc.date.available
2016-05-30T07:05:38.250Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7647
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11846
dc.description.abstract
Der TSHR ist ein Vertreter der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Er
wird hauptsächlich in der basolateralen Membran der Follikelepithelzellen der
Schilddrüse exprimiert und ist an der Regulation vieler metabolischer Prozesse
des Körpers beteiligt. Angeborene und erworbene Mutationen des TSHR haben oft
eine Hypothyreose bzw. Hyperthyreose zur Folge. Morbus Basedow ist TSHR-
abhängige Autoimmunerkrankung. Eine besondere Form des Morbus Basedow stellt
die Endokrinen Orbithopathie (EO) dar. Die Stimulation des TSHR durch die
Autoantikörper führt bei EO zu einer verstärkten Zellproliferation und
Zellausdifferenzierung zu Adipozyten. Diese Prozesse haben eine Volumenzunahme
des orbitalen Bindegewebes und einen Exophtalmus zur Folge. Die bislang
eingesetzten Medikamente bei Morbus Basedow unterbinden die Synthese der
Schilddrüsenhormone und haben daher keinen Einfluss auf den Verlauf der EO.
Die Identifizierung kleiner Moleküle, die direkt am TSHR wirken, ist daher von
besonderer Bedeutung. Die Bindungstasche kleiner Moleküle vieler GPCR befindet
sich innerhalb des transmembranären Bereiches und wird durch Aminosäuren der
angrenzenden Helizes ausgekleidet. Die Optimierung der kleinen Moleküle in
ihrer Wirkung setzt die Kenntnis über deren räumliche Orientierung im Rezeptor
und damit die der funktionalen Gruppen der umgebenden Aminosäuren voraus. Für
die transmembranäre Domäne des TSHR gibt es momentan noch keine
Kristallstruktur. Der erste Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag daher
darauf, den Einfluss der Position 5935.50 auf die Konformation der
transmembranären Helix (TMH) 5 zu untersuchen. Im Detail sollte die
Orientierung der Aminosäuren an der TMH5 geklärt werden. Hierfür wurden TSHR-
Mutanten generiert und funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse dieser
Arbeit lassen auf eine reguläre α-helikale Struktur der TMH5 im TSHR
schließen. Die gewonnenen Daten über die strukturelle Konformation der TMH5
wurden für die Optimierung des TSHR-Homologiemodells genutzt, welches für die
Docking-Studien kleiner Liganden von besonderer Bedeutung ist. Im zweiten Teil
dieser Arbeit konnte ein zellbasiertes High Throughput Screening (HTS) zur
Identifizierung von TSHR-Antagonisten etabliert und erfolgreich durchgeführt
werden. Die Auswertung des primären HTS und die anschließende Bestimmung der
konzentrations-abhängigen Inhibierung des Rezeptors durch die Substanzen, der
Ausschluss falsch positiver Hits und sowie die Verifizierung der Substanzen
sekundärem Screening in HEK293T-TSHR-Zellen führte zu drei Substanzen. Als
Resultat konnte ein an dem TSHR selektiv wirkender Antagonist, die Substanz
S37, identifiziert werden. Die anschließende pharmakologische
Charakterisierung ergab, dass S37 selektiv in einer konzentrationsabhängigen
Weise auf den TSHR wirkt und keine zytotoxische Aktivität zeigt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit erfolgreich Sequenz-Struktur-
Funktions-analysen zur Klärung der TMH5-Konformation im TSHR und ein HTS zur
Identifizierung von TSHR-Antagonisten durchgeführt. Im Zuge dessen konnte eine
Substanz mit selektivem antagonistischem Effekt auf den TSHR als Grundlage für
weitere Optimierungen identifiziert werden.
de
dc.description.abstract
The TSHR is a G-protein-coupled receptor (GPCR) and belongs to the subclass of
glycoprotein hormone receptors. It is involved in the regulation of many
metabolic processes in the human body. Receptor activation by its endogenous
ligand – the thyroid-stimulating hormone (TSH, thyrotropin) – leads to
production of second messengers such as cAMP or IP3. These in turn regulate
the iodine uptake, thyroglobulin synthesis, endocytosis and proteolysis,
peroxidase activity, iodination and hormone secretion. TSHR is mainly
expressed in follicular epithelial cells of the thyroid gland. The receptor
expression has also been detected in non-thyroid tissue, such as orbital
fibroblasts (OF), bones, gonads and kidneys. Congenital and somatic mutations
of the TSHR often cause hypothyroidism or hyperthyroidism. Uncontrolled
receptor activation by autoantibodies directed against the TSHR results in an
autoimmune disorder known as Graves’ disease. Thyroid-associated endocrine
orbitopathy is one of the most typical symptoms of Graves’ disease. This
ocular manifestation includes tissue inflammation, proptosis, corneal exposure
and optic nerve compression. TSHR activation by autoantibodies is considered
as a key process of EO and leads to cell proliferation and cell
differentiation. The current therapy for Graves’ disease is confined to
restricting the synthesis of thyroid hormones and thus has no effect on the
course of EO. At the moment, there are no drugs available on the market that
target the TSHR directly. The direct suppression of the pathological TSHR
activation by low molecular weight (LMW) molecules could be a potential
approach for treating Graves’ disease or EO. The first aim of this thesis was
to prove if transmembrane helix 5 (TMH5) of the TSHR exhibits a conformation
different from that found in most other family-A GPCRs. The biochemical and
structural characterization of TSHR mutants was utilized to clarify the
conformation of TMH5. Within family-A GPCRs, a highly conserved proline can be
found at position 5.50 in TMH5 which causes a twist in the helix structure. In
contrast, all glycoprotein hormone receptors have an alanine at this position.
The influence of the position 5935.50 on the conformation of TMH5 and thus
also on ligand-binding was to be examined in detail. To gain insights into the
functionality of this position, alanine was exchanged with proline, glycine
and valine using site-directed mutagenesis. The generated TSHR mutants were
characterized in terms of cell-surface expression and basal and thyrotropin-
induced cAMP accumulation. The functional data of the mutants show changes
either in cell-surface expression, in signaling or both. Based on this
functional data, the conclusion was drawn that TSHR might have a different
conformation from most other family-A GPCRs by a regular α-helix.
Consequently, the lack of the proline at position 5.50 in the TSHR leads to a
shift of amino acids by one position. In turn, this results in a different
orientation of the amino acids in the N-terminal region of the TMH5, and also
within the transmembrane binding pocket. The obtained data explained
previously reported mutational effects in this region and were used for the
optimization of the TSHR homology model, which is of particular importance for
docking studies of small ligands. The second part of the thesis focuses on the
establishment and implementation of a cell-based HTS assay to identify a lead
structure that provides starting points for the development of a selective
antagonist for the TSHR. The completion of the primary screen of 16000
compounds performed in the CHO-K1-TSHR cell line resulted in 350 positive
hits. The determination of the dose-dependent inhibition of these compounds,
together with the exclusion of false positive hits through testing them in the
CHO-K1 cell line without TSHR, led to the identification of 12 compounds. The
verification of these 12 compounds was performed in a secondary screen using a
HEK293T-TSHR cell line, ultimately leading to the identification of three
compounds with antagonistic activity towards the TSHR. Two compounds, S4 and
S9, were selected and formed the basis for further structure-function
analysis. The experimental testing of 24 derivatives led to the identification
of compound S37, a selective TSHR antagonist. S37 is a product of a
stereoselective synthesis from compound S4 and is a stereoisomer in endo-
conformation. The pharmacological characterization revealed that substance S37
is not toxic in a HEK293T-TSHR cell line and inhibits TSHR activation in a
dose-dependent manner. The special advantage of substance S37 is that it is
strictly TSHR-selective and has no effects on the homologous receptors LHCGR
and FSHR. In summary, sequence-structure-function analysis to clarify the TMH5
conformation of the TSHR as well as a HTS for TSHR antagonists were
successfully performed in the course of this thesis´ work. The latter resulted
in the identification of a compound with selective TSHR antagonistic effect
that represents a base for further optimization.
en
dc.format.extent
v, 125 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
thyroid-stimulating hormone receptor
dc.subject
small molecules, GCPR
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Struktur–Funktionsanalysen intramolekularer Signalisierungsmechanismen und
pharmakologische Intervention am Thyreoidea-stimulierenden Hormon Rezeptor
dc.contributor.contact
inna_hoyer@oceane.de
dc.contributor.firstReferee
Dr. Gerd Krause
dc.contributor.furtherReferee
PD. Dr. Hartmut Oschkinat
dc.date.accepted
2015-04-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000102086-3
dc.title.translated
Structure-function analysis of intramolecular signaling mechanisms and
pharmacological intervention on thyroid-stimulating hormone receptor
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000102086
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000019240
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access