The cooperation of pairs of proteins or the formation of large functional complexes of proteins is required for most if not all biological processes. Therefore, investigation of protein-protein interactions (PPI) within a cell is essential for the elucidation of biological processes and cellular networks. The two-hybrid system is the most commonly used method for PPI analyses. Hitherto, high-throughput analyses are almost exclusively performed in yeast, even when studying mammalian proteins. Putative interactions are subsequently confirmed in mammalian two-hybrid assays on a gene-by-gene basis.
The present work aimed at establishing a high-throughput, cost-effective method for analysing protein-protein-interactions directly in mammalian cells. This was achieved by combining mammalian two-hybrid system with transfected cell microarray to create the cell array-based protein-protein-interaction assay (CAPPIA). As for PCR- or oligonucleotide microarrays, the DNA samples were spotted and immobilized on glass slides in array formats. Each DNA spot contained bait and prey expression plasmids in addition to a reporter plasmid, which codes for an autofluorescent protein. After spotting the vector constructs, adherent human cells were added, creating a monolayer on the surface of the slides. Only cells growing on top of the DNA spots became transfected. In case of chimeric bait and prey protein interaction, the reporter gene was expressed, resulting in fluorescent reporter protein. Signals resulting from PPI were analyzed directly by fluorescence detection, without the need for further manipulation of the slides such as immunofluorescent staining or enzyme-based detection.
At first, production of the cell array slides and transfection conditions were optimised. Subsequently CAPPIA was shown to specifically and quantitatively detect protein-protein interactions in various mammalian cell lines. Moreover, screening of a small prey library against the human androgen receptor demonstrated that CAPPIA is well suited for the detection of hormone-dependent protein-protein-interactions. This was underscored by showing the dose- response of these interactions to androgenic compounds as well as to anti- androgenic reagents. Finally, it was shown that the possible combinatorial screens could be increased by application of slides without bait. For this purpose microarrays consisted of spots containing one plasmid of a prey- library together with the reporter plasmid were designed. These so-called prey-reporter slides (PR-slides) were then analysed with cell lines that carried a stably or transiently expressed bait.
The high sample capacity of the cell arrays and the low reagent consumption make CAPPIA currently the most economical high-throughput detection assay for protein-protein interactions in mammalian cells. For this reason CAPPIA can become an important tool to increase the knowledge of the human interactome and thus of functional genomics.
Proteinpaare bzw. größere funktionelle Proteinkomplexe sind an den meisten wenn nicht sogar an allen biologischen Vorgängen beteiligt. Aus diesem Grund ist die Erforschung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) essentiell für die Aufklärung von biologischen Prozessen und zellulären Netzwerken. Eine sehr leistungsstarke und häufig verwendete Methode für die Analyse von PPI ist hierbei das Zwei-Hybrid-System (two-hybrid system). Bisher werden Hochdurchsatzanalsysen (high-throughput analysis) mit diesem Verfahren aber fast ausschließlich in Hefe durchgeführt, sogar für die Erforschung von Säugerproteinen. Potentielle Interaktionen werden dann anschließend Gen für Gen mit Säuger-Zwei-Hybrid-Untersuchungen überprüft.
Die hier beschriebene Arbeit hatte die Etabliereung einer neuen, kosteneffektiven Methode für die Hochdurchsatzanalyse von PPI direkt in Säugerzellen zum Ziel. Hierfür wurde das Säuger-Zwei-Hybrid-System mit transfizierten Zell-Microanordnungen (cell microarrays) zu einem neuen Verfahren, genannt CAPPIA (cell array based protein-protein-interaction assay), kombiniert. Entsprechend der Methode von PCR- oder Oligonucleotid- Microanordnungen wurden hierbei Proben in definiertem Muster auf Objektträgern aufgetragen und dabei auf der Oberfläche fixiert. Die Proben enthielten vergleichbar anderen Säuger-Zwei-Hybrid-Systemen sogenannte Köder- (bait) und Opfer- (prey) Expressionsplasmide zusammen mit einem Reporterplasmid, das im vorliegenden Fall für ein autofluoreszierendes Protein codierte. Nach dem Auftragen der vektorkonstruierten Proben auf den Objektträgern wurden diese mit menschlichen, adherenten Zellen bedeckt. Diese setzten sich einschichtig auf der gesamten Oberfläche fest, aber nur die Zellen, die direkt auf den aufgetragenen DNA-Punkten (DNA spots) wuchsen, wurden durch die Proben transfiziert. Im Falle einer Interaktion der chimären Köder- und Opfer- Proteine hatte das die Expression des Reporterproteins zur Folge. Diese aus einer PPI resultierenden Signale wurden anschließend mit Hilfe von Fluoreszenznachweisen analysiert, ohne das es einer weiteren Bearbeitung der Objektträger wie Immunofluoreszenzfärbung oder Nachweisen auf enzymatischer Basis bedurfte.
Zunächst wurden die Produktion der Zellanordnungs-Objektträger und die entsprechenden Transfektionsbedingungen optimiert. Anschließend konnte nachgewiesen werden, dass CAPPIA Protein-Protein-Interaktionen in unterschiedlichen Säugerzellen spezifisch und quantitativ ermitteln kann. Darüber hinaus bestätigte das Durchsuchen einer kleinen Bibliothek von Opfer- Plasmiden, die in Beziehung zum menschlichen Androgenrezeptor standen, dass CAPPIA gut geeignet ist für den Nachweis von hormonabhängigen Protein-Protein- Interaktionen. Das wurde noch bekräftigt durch die Darstellung der Dosisabhängigkeit dieser Interaktionen - sowohl auf androgene als auch auf antiandrogene Reagenzien. Schließlich wurde demonstriert, dass die Kombinationsmöglichkeiten und damit die Effektivität des Durchsuchens gesteigert durch werden kann durch die Verwendung von Objektträgern, auf denen kein Köder-Plasmid aufgetragen ist. Jeder DNA-Fleck besteht hier nur jeweils aus einem Plasmid aus einer Opfer-Bibliothek zusammen mit dem Reporterplasmid. Diese Objektträger wurden dann mit Zellen analysiert, die stabil oder transient mit einem Köder-Plasmid transfiziert waren.
Die hohe Kapazität von Proben auf den Zellananordnungen und der geringe Verbrauch an Reagenzien machen CAPPIA zurzeit zum ökonomischsten Hochdurchsatzverfahren für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in Säugerzellen. Damit kann sich CAPPIA zu einem wichtigen Werkzeug im Bereich der menschlichen Interakteom- und funktionellen Genomforschung entwickeln.
