dc.contributor.author
Fiebitz, Andrea
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:16:08Z
dc.date.available
2007-01-25T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7636
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11835
dc.description
Title 0
Summary VII
Zusammenfassung IX
1. Introduction 1
2. Material and Methods 11
3. Results 31
4. Discussion 66
References 81
Appendix 92
dc.description.abstract
The cooperation of pairs of proteins or the formation of large functional
complexes of proteins is required for most if not all biological processes.
Therefore, investigation of protein-protein interactions (PPI) within a cell
is essential for the elucidation of biological processes and cellular
networks. The two-hybrid system is the most commonly used method for PPI
analyses. Hitherto, high-throughput analyses are almost exclusively performed
in yeast, even when studying mammalian proteins. Putative interactions are
subsequently confirmed in mammalian two-hybrid assays on a gene-by-gene basis.
The present work aimed at establishing a high-throughput, cost-effective
method for analysing protein-protein-interactions directly in mammalian cells.
This was achieved by combining mammalian two-hybrid system with transfected
cell microarray to create the cell array-based protein-protein-interaction
assay (CAPPIA). As for PCR- or oligonucleotide microarrays, the DNA samples
were spotted and immobilized on glass slides in array formats. Each DNA spot
contained bait and prey expression plasmids in addition to a reporter plasmid,
which codes for an autofluorescent protein. After spotting the vector
constructs, adherent human cells were added, creating a monolayer on the
surface of the slides. Only cells growing on top of the DNA spots became
transfected. In case of chimeric bait and prey protein interaction, the
reporter gene was expressed, resulting in fluorescent reporter protein.
Signals resulting from PPI were analyzed directly by fluorescence detection,
without the need for further manipulation of the slides such as
immunofluorescent staining or enzyme-based detection.
At first, production of the cell array slides and transfection conditions were
optimised. Subsequently CAPPIA was shown to specifically and quantitatively
detect protein-protein interactions in various mammalian cell lines. Moreover,
screening of a small prey library against the human androgen receptor
demonstrated that CAPPIA is well suited for the detection of hormone-dependent
protein-protein-interactions. This was underscored by showing the dose-
response of these interactions to androgenic compounds as well as to anti-
androgenic reagents. Finally, it was shown that the possible combinatorial
screens could be increased by application of slides without bait. For this
purpose microarrays consisted of spots containing one plasmid of a prey-
library together with the reporter plasmid were designed. These so-called
prey-reporter slides (PR-slides) were then analysed with cell lines that
carried a stably or transiently expressed bait.
The high sample capacity of the cell arrays and the low reagent consumption
make CAPPIA currently the most economical high-throughput detection assay for
protein-protein interactions in mammalian cells. For this reason CAPPIA can
become an important tool to increase the knowledge of the human interactome
and thus of functional genomics.
de
dc.description.abstract
Proteinpaare bzw. größere funktionelle Proteinkomplexe sind an den meisten
wenn nicht sogar an allen biologischen Vorgängen beteiligt. Aus diesem Grund
ist die Erforschung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) essentiell für die
Aufklärung von biologischen Prozessen und zellulären Netzwerken. Eine sehr
leistungsstarke und häufig verwendete Methode für die Analyse von PPI ist
hierbei das Zwei-Hybrid-System (two-hybrid system). Bisher werden
Hochdurchsatzanalsysen (high-throughput analysis) mit diesem Verfahren aber
fast ausschließlich in Hefe durchgeführt, sogar für die Erforschung von
Säugerproteinen. Potentielle Interaktionen werden dann anschließend Gen für
Gen mit Säuger-Zwei-Hybrid-Untersuchungen überprüft.
Die hier beschriebene Arbeit hatte die Etabliereung einer neuen,
kosteneffektiven Methode für die Hochdurchsatzanalyse von PPI direkt in
Säugerzellen zum Ziel. Hierfür wurde das Säuger-Zwei-Hybrid-System mit
transfizierten Zell-Microanordnungen (cell microarrays) zu einem neuen
Verfahren, genannt CAPPIA (cell array based protein-protein-interaction
assay), kombiniert. Entsprechend der Methode von PCR- oder Oligonucleotid-
Microanordnungen wurden hierbei Proben in definiertem Muster auf Objektträgern
aufgetragen und dabei auf der Oberfläche fixiert. Die Proben enthielten
vergleichbar anderen Säuger-Zwei-Hybrid-Systemen sogenannte Köder- (bait) und
Opfer- (prey) Expressionsplasmide zusammen mit einem Reporterplasmid, das im
vorliegenden Fall für ein autofluoreszierendes Protein codierte. Nach dem
Auftragen der vektorkonstruierten Proben auf den Objektträgern wurden diese
mit menschlichen, adherenten Zellen bedeckt. Diese setzten sich einschichtig
auf der gesamten Oberfläche fest, aber nur die Zellen, die direkt auf den
aufgetragenen DNA-Punkten (DNA spots) wuchsen, wurden durch die Proben
transfiziert. Im Falle einer Interaktion der chimären Köder- und Opfer-
Proteine hatte das die Expression des Reporterproteins zur Folge. Diese aus
einer PPI resultierenden Signale wurden anschließend mit Hilfe von
Fluoreszenznachweisen analysiert, ohne das es einer weiteren Bearbeitung der
Objektträger wie Immunofluoreszenzfärbung oder Nachweisen auf enzymatischer
Basis bedurfte.
Zunächst wurden die Produktion der Zellanordnungs-Objektträger und die
entsprechenden Transfektionsbedingungen optimiert. Anschließend konnte
nachgewiesen werden, dass CAPPIA Protein-Protein-Interaktionen in
unterschiedlichen Säugerzellen spezifisch und quantitativ ermitteln kann.
Darüber hinaus bestätigte das Durchsuchen einer kleinen Bibliothek von Opfer-
Plasmiden, die in Beziehung zum menschlichen Androgenrezeptor standen, dass
CAPPIA gut geeignet ist für den Nachweis von hormonabhängigen Protein-Protein-
Interaktionen. Das wurde noch bekräftigt durch die Darstellung der
Dosisabhängigkeit dieser Interaktionen - sowohl auf androgene als auch auf
antiandrogene Reagenzien. Schließlich wurde demonstriert, dass die
Kombinationsmöglichkeiten und damit die Effektivität des Durchsuchens
gesteigert durch werden kann durch die Verwendung von Objektträgern, auf denen
kein Köder-Plasmid aufgetragen ist. Jeder DNA-Fleck besteht hier nur jeweils
aus einem Plasmid aus einer Opfer-Bibliothek zusammen mit dem Reporterplasmid.
Diese Objektträger wurden dann mit Zellen analysiert, die stabil oder
transient mit einem Köder-Plasmid transfiziert waren.
Die hohe Kapazität von Proben auf den Zellananordnungen und der geringe
Verbrauch an Reagenzien machen CAPPIA zurzeit zum ökonomischsten
Hochdurchsatzverfahren für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in
Säugerzellen. Damit kann sich CAPPIA zu einem wichtigen Werkzeug im Bereich
der menschlichen Interakteom- und funktionellen Genomforschung entwickeln.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Protein-Protein-Interaction
dc.subject
Two-Hybrid System
dc.subject
High-Throughput
dc.subject
Androgen Receptor
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
High-Throughput SCcreening of Protein-Protein-Interactions in Mammalian Cells
Using Transfected Cell Arrays
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerd Multhaup
dc.date.accepted
2006-12-19
dc.date.embargoEnd
2007-01-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002672-2
dc.title.translated
Ein Hochdurchsatz-Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in
Säugerzellen mit Hilfe von transfizierten Zell-Arrays
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002672
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/59/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002672
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dcterms.accessRights.openaire
open access