Grundlagen: MHC-I-defiziente Ratten-Aorten-Endothelzellen (RAEC) konnten durch lentiviralen Gentransfer eines a-MHC-I-Antikörpers hergestellt werden. Die RAEC konnten verwendet werden um azellularisierte vaskuläre Matrizes luminal mit einer Endothel-artigen Zellschicht auszukleiden. Die im Rahmen des Tissue Engineering auf diese Weise erzeugten Gefäßtransplantate wurden in einem Transplantationsmodell als Gefäßersatzstücke in der Position der abdominalen infrarenalen Aorta in Ratten End-zu End implantiert. Die nach vierwöchigem Verbleib im Empfänger entnommenen Transplantate konnten mit Hilfe molekularer (PCR), und mikroskopiebasierter Untersuchungsmethoden (Immunhistologie und Immunmorphometrie) zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Abstoßungsreaktionen in syngenen und allogenen Gefäßtransplantationen genutzt werden. Das Erkennen von Zellen mit einer verminderten MHC-I-Expression stellt einen wichtigen Aktivierungsreiz für die zytotoxische Aktivität Natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) dar. Die NK-Zell-vermittelte Immunogenität der MHC-I-defizienten RAEC ist daher für deren Verwendbarkeit in Gefäßersatzstücken von entscheidender Bedeutung. Material und Methoden: Durch die Kombination von Dichtezentrifugation, MACS-Separation und Filtrierung durch Nylonwolle konnte ein neu etabliertes Isolationsprotokoll erstellt werden, welches die Gewinnung vitaler, NKRP1(+) Zellen in hoher Reinheit aus Rattenmilzen ermöglicht. Nach erfolgter Reinheitsbestimmung konnte die Reaktivität der größtenteils Natürlichen Killerzellen entsprechenden NKRP1(+) Zellen gegenüber RAEC in Zytotoxizitätstests bestimmt werden. Die Reinheitsbestimmung der NK-Zell-Isolate sowie die Quantifizierung der MHC-I-Expressionshemmung erfolgten mittels Durchflusszytometrie(FACS). Im Rahmen von Transplantationsversuchen wurde der empfängereigene, infrarenale Teil der abdominellen Aorta aus Ratten vom Stamm Lewis durch die im Rahmen des Tissue-Engineering-Prozesses gewonnenen Gefäßtransplantate ersetzt. Basierend auf den verschiedenen Komponenten der Gefäßersatzstücke wurden fünf Versuchsgruppen gebildet. Die Transplantate der fünf verschiedenen Gruppen enthielten bezogen auf die Empfänger syngene LEW-RAEC, allogene DA-RAEC, allogene, transduzierte, MHC-I-defiziente OX18-RAEC, allogene, kontroll- transduzierte, nicht-MHC-I-defiziente GFP-RAEC und zellfreie Matrices. Nach vierwöchigem Verbleib in den Empfängern wurden die Gefäßtransplantate explantiert und immunmorphometrisch, immunhistochemisch und mittels quantitativer RT-PCR untersucht. Im Rahmen der immunhistochemischen Untersuchungen wurden in den aus den Gefäßtransplantaten nach Explantation angefertigten Gewebeschnitten mit Hilfe der ausgewählten spezifischen, farbstoffmarkierten Antikörper folgende Zellpopulationen markiert: T-Zellen (TCR+), Monozyten/Makrophagen (ED1+), Leukozyten (CD45+), NK-Zellen (NKRP1+), Endothelzellen (CD31+). Bei der anschließend durchgeführten Immunmorphometrie wurden die zellspezifischen Farbstoffsignale computerbasiert in den zuvor markierten Gefäßwandschichten ausgezählt. Somit ließen sich Infiltratstärken der markierten immunkompetenten Zellen in den Transplantatschnitten verschiedener Gruppen quantifizieren, vergleichen und statistisch auswerten. Resultate: NK-Zellen (NKRP1+) ließen sich aus Rattenmilzen mit einer durchschnittlichen Reinheit von 74% anreichern. Die Vitalität und Reaktivität der aus Rattenmilzen isolierten NK-Zellen gegenüber der murinen Tumorzellinie YAC-1 konnte durch eine vollständige Lyse aller Tumorzellen nachgewiesen werden. Im Vergleich der Immunogenität der verschiedenen RAEC zeigte sich in Effektor:Zielzell-Verhältnissen von 1,25:1 bis 10:1 in den Zytotoxizitätstests keine verstärkte Immunogenität von MHC-I-armen RAEC verglichen mit syngenen RAEC. Bei der Verwendung der RAEC als zellulärer Komponente von Gefäßersatzstücken im in-vivo-Transplantationsmodell zeigte sich ebenfalls keine erhöhte Immunogenität von NK-Zellen gegenüber Gefäßersatzstücken mit transduzierten RAEC, weder den kontrolltransduzierten RAEC, die nur ein grünes Fluoreszensprotein exprimierten (GFP-RAEC) noch den transduzierten RAEC mit dem Gen für den a-MHC-I-Intrabody (OX18 RAEC). Allerdings war nach vierwöchigem Verbleib im Empfänger keine signifikante MHC-I-Defizienz der entsprechend transduzierten RAEC mehr nachweisbar. Eine Immunprivilegierung aufgrund der Transduktion mit dem hrGFP-Gen erschien ebenfalls möglich. In den immunhistochemisch markierten, mikroskopischen Fotografien der Gewebeschnitte mit transduzierten RAEC zeigte sich nach vierwöchigem Verbleib im Empfänger eine stärkere Neo-Intima-Formation als in den Gefäßersatzstücken mit untransduzierten RAEC. Immunmorphometrisch ließ sich in Bezug auf T-Zell-, Makrophagen/Monozyten- und NK-Zell-Infiltration kein signifikanter Unterschied zwischen Gefäßstücken mit transduzierten und denen mit untransduzierten RAEC feststellen. Nach der PCR-basierten Analyse anderer immunologisch relevanter Zellen (T-Zellen, Makrophagen/Monozyten, B-Zellen) und Zytokine (IFNg) sowie funktionsrelevanter Moleküle (eNOS, Tissue Factor) zeigten sich einige Ergebnisse, die die der Bildmorphometrie bestätigten. Alle Gefäßtransplantate wiesen bezüglich der T-Zell-spezifischen CD3-Expression und der Genexpression des proinflammatorischen Chemokins IP10 (CXCL 10) vier Wochen nach Implantation vergleichbare Werte auf. Die immunmorphometrisch gezeigte vergleichbare T-Zell-und NK-Zell-Infiltration in Gefäßen mit transduzierten RAEC und mit nicht-transduzierten RAEC wurde auf molekularer Ebene eher bestätigt als widerlegt. Die RT-PCR-Daten deuten aber bezüglich der Interferon gamma-Genexpression darauf hin, dass es im Vergleich zwischen Gefäßstücken mit transduzierten und Gefäßstücken mit nicht-transduzierten RAEC eine stärkere immunologische Reaktion auf die transduzierten RAEC gab, welche gegenüber den syngenen RAEC mit veränderter Gerinnungs- und Gefäßweitenregulation reagierten. Diskussion: Ein neues Isolationprotokoll zur Gewinnung von NK- Zellen aus Rattenmilzen in hoher Reinheit konnte etabliert werden. Die funktionsfähigen NK-Zellen eignen sich zur Durchführung von Zytotoxizitäts- Tests mit transduzierten und nicht-transduzierten RAEC sowie der murinen Tumorzelllinie YAC-1. Transduzierte RAEC zeigen in vitro trotz MHC-I-Oberflächendefizienz keine erhöhte NK-Zell-Reaktivität gegenüber untransduzierten RAEC. Die transduzierten und nicht-transduzierten RAEC eignen sich daher zur Besiedlung azellularisierter Bindegewebsmatrices aus abdominalen Rattenaorten. Die so gewonnenen Gefäßersatzstücke konnten erfolgreich in einem Aorteninterpositions-modell in Ratten transplantiert werden. Nach vierwöchigem Verbleib im Transplantatempfänger wurden die Gefäßersatzstücke explantiert und zeigten in den durchgeführten Untersuchungen zur Charakterisierung der Abstoßungsreaktion Zeichen einer abgelaufenen akuten Abstoßungsreaktion durch Nachweis einer Neo-Intima-Formation (Immunhistologie). Immunmorphometrisch zeigte sich nach vierwöchigem Verbleib im Empfänger keine signifikant erhöhte Infiltration mit immunkompetenten Zellen. Auf molekulargenetischer Ebene (RT-PCR) zeigen sich für inflammationsrelevante Gene (Interferon gamma, IP 10) ebenso keine signifikanten Unterschiede zwischen transduzierten und nicht-transduzierten RAEC. Hinsichtlich funktionsrelevanter Gene (eNOS, tissue factor) konnte jedoch ein signifikant erhöhtes Genexpressionsniveau in intrabody-haltigen RAEC (OX18-RAEC) gegenüber untransduzierten RAEC gezeigt werden. Die Veränderung der Expression funktionsrelevanter Gene könnte Folge einer abgelaufenen Immunreaktion mit Neo-Intima Formation und damit gestörten Gefäßweitenregulation und Beeinträchtigung der Endothelzellfunktion sein. Aus ungeklärter Ursache zeigten die immunmorphometrischen Messungen, dass sich nach viewöchigem Verbleib im Empfänger auf den vor Implantation mit transduzierten RAEC besiedelten Gefäßersatzstücken keine verringerte MHC-I-Oberflächenexpression in den Intimae gegenüber den mit untransduzierten RAEC besiedelten Gefäßersatzstücken mehr nachweisen ließ. Von C. Doebis et al konnte zuvor in vitro gezeigt werden, dass humorale und zelluläre Abstoßungsreaktionen durch die hier verwendeten transduzierten RAEC signifikant verringert werden konnte. Eine instabile Transduktion oder das Überwuchern transduzierter RAEC durch nicht erfolgreich transduzierte, allogene RAEC könnten eine mögliche Ursache darstellen.
MHC (major histocompatibility) class I deficient rat aortic endothelial cells (RAEC) have been generated in the past by expression of an anti-MHCI- intrabody. The MHC-I-downregulation was demonstrated to be possible by lentiviral gene transfer. Transduction with a gene for an anti-MHC-I-intrabody was shown to be an efficient treatment for avoiding humoral and CTL-mediated immune attacks. against these cells as a component of vascular grafts (C. Doebis et al.). Those cells can be used are interesting tools for seeding of acellularized vascular matrices for generating vascular allografts. However, due to their MHC I deficiency RAEC may become In physiological conditions MHCI-deficient cells are, beside virally infected cells, one a main target of Natural -Killer (NK) -cell (NK-cell) lysis. Therefore the MHCI modulated RAEC could become a target of NK cell response. In this work we examined the NK- Cell mediated lysis towards allogeneic MHC-I modulated RAEC, one important component of our tissue-engineered small calibre vascular grafts. We developed a four step isolation protocol to isolate NKRP1(+)TCR(-) rat NK cells from rat spleen with which NK Cells can be isolated in high purity. We performed cytotoxicity assays after phenotypical characterization by FACS analysis. It could be shown that there were similar NK-Cell responses to the MHC-I modulated RAEC compared with untransduced syngeneic and allogeneic endothelial cells, in vitro. These results allowed us to use these RAEC as a major component in vascular constructs of luminal seeded decellularized vascular matrices. These vascular grafts seeded with syngeneic (LEW), allogeneic (DA) and transduced RAEC were transplanted in an abdominal infrarenal rat aortic replacement procedure and explanted after four weeks. The grafts were analyzed by immunehistochemical, immunemorphometrical and RT-PCR analysis. Although there were no significant signs of NK-Cell mediated acute graft rejection there was a neo-intima formation in grafts seeded with transduced RAEC.
