Eine Infektion mit dem zur Familie der Herpesviren gehörenden humanen Zytomegalievirus (HCMV) nimmt bei Immunkompetenten i.d.R. einen asymptomatischen Verlauf. Gefährdet, sowohl durch eine Erstinfektion, als auch durch die endogene Reaktivierung des latent im Körper verweilenden Erregers, sind jedoch Patienten nach Organtransplantation, AIDS-Patienten sowie Un- und Frühgeborene. Klinisch können gravierende Organbeteiligungen und nicht selten fatale Krankheitsverläufe resultieren. Goldstandard zur therapeutischen Intervention ist das Nukleosidanalogon Ganciclovir, dessen Einsatz in den letzten Jahren vermehrt zum Auftreten phänotypisch resistenter HCMV-Stämme führte. Als genotypisches Korrelat der Resistenzentwicklung konnten Mutationen in den open reading frames (ORFs) UL97 und UL54 des Virusgenoms verantwortlich gemacht werden. Um diese frühestmöglich zu detektieren und eine Therapieumstellung zu ermöglichen, existieren genotypische Nachweisverfahren, die sich insbesondere in ihrer Sensitivität hinsichtlich der Erkennung geringer Mutantenanteile in mischinfiziertem Patientenmaterial unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, dahingehend verschiedene moderne Sequenzierungsmethoden mit der derzeit im klinischen Alltag etablierten Sanger-Sequenzierung zu vergleichen. Dabei erfolgte zunächst die Analyse des ORFs UL97 in klinischen Patientenproben mit dem Verfahren der Pyrosequenzierung sowie der Vergleich der ermittelten Sequenzen mit den Ergebnissen der Methode nach Sanger, wobei die Pyrosequenzierung als sensitiveres der beiden Verfahren bestätigt werden konnte. Anschließend erfolgte die Untersuchung ausgewählter Proben mit Hilfe der Amplicon- Sequenzierung. Wurde in einer Probe mehr als eine Mutation detektiert, so konnte mit Hilfe der Klonierung zwischen dem gleichzeitigen Auftreten einzeln mutierter Virusstämme und dem Vorliegen von Doppelmutanten unterschieden werden. Patientenproben mit hoher Viruslast wurden zudem mit Hilfe der Sanger- Sequenzierung auf das Vorhandensein Resistenz-assoziierter Mutationen im ORF UL54 untersucht. Eine derartige Mutation konnte jedoch im vorhandenen Patientenmaterial nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend betrachtet stellt die Methode der Pyrosequenzierung derzeit das bevorzugte Verfahren dar, da sie bei überschaubarem Zeit- und Kostenaufwand einen gezielten Nachweis Resistenz- assoziierter Mutationen ermöglicht und insbesondere hinsichtlich der Detektion minoritärer Mutantenanteile in Virusmischpopulation der Sanger-Sequenzierung überlegen ist. Vielversprechend sind insbesondere hinsichtlich ihrer hohen Durchsatzrate auch neuere Verfahren des Next Generation Sequencing, wobei hier neben einer Kostenoptimierung weitere Studien zur Evaluation von Sensitivität und Sicherheit der Methode abzuwarten sind.
In immunocompetent individuals, infections with human cytomegalovirus, which belongs to the herpesvirus family, usually causes mild or no symptoms. In contrary, primary infection or reactivation of the latent infection that the virus establishes for the lifetime of its host endangers immunocompromised individuals such as transplant recipients or HIV patients and unborn children. For those the infection can lead to severe morbidity which might be fatal. The nucleoside analog Ganciclovir is currently the therapeutic gold standard for treating HCMV. Its increased use led to the appearance of phenotypic resistant virus over the last few decades. Genotypic methods identified the origin of those resistances in mutations in the ORFs UL97 and UL54 of the virus genome. Multiple methods for sensitive and early detection of resistance-associated mutations exist that differ especially in their ability in detecting minor amounts of resistant viruses in a mixed population. The goal of this work was to evaluate different modern sequencing methods and compare their abilities in early detection of relevant mutations with Sanger sequencing, which is used in clinical standard diagnostics. First, analysis of HCMV ORF UL97 in clinical samples using pyrosequencing assays was compared with the results of Sanger sequencing, which confirmed pyrosequencing a higher sensitivity. Afterwards selected samples were additionally analyzed by next generation sequencing. If more than one mutation was detected in one sample a cloning approach was used to differentiate between two independent virus strains with each carrying one of the mutations and the appearance of a twofold mutated strain. Furthermore clinical samples with high viral loads where tested for the existence of resistance-associated mutations in ORF UL54. The latter could not be detected in the material analyzed. All in all pyrosequencing currently seems to be the most recommendable sequencing approach in detecting HCMV UL97 mutations. Its costs and expenditure of time are manageable and it outmatches classic Sanger sequencing in verification of minor mutated strains in mixed virus populations. Especially regarding its high throughput next generation sequencing is promising as well. Presently an improvement of costs and an evaluation of its sensitivity are needed to define its role in routine diagnostics.
