Infections of horses with the equine herpes virus type 1 (EHV-1) can result in rhinopneumonitis, abortion in pregnant mares, and sometimes fatal neurological disorder. The virus primarily replicates in the epithelium of the upper respiratory tract, and subsequently spreads via leukocyte-associated viraemia to secondary sites of infection (endothelia of blood and lymphatic vessels). Thusly, the infection is thought to be mainly controlled by the action of virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) as precursor CTL frequencies clearly correlate with protection. High neutralizing antibody titers can be induced by several commercial vaccines, but complete protection from infection and disease is only achieved in horses multiply infected with virulent strains. CTL recognize an infected cell by binding with their polymorphic T cell receptors (TCR) to a complex of pathogen-derived peptide and surface major histocompatibility complex class I molecules (MHC-I). MHC-I molecules bind peptides of intracellular origin according to their binding motifs mediated by polymorphic residues in the peptide-binding groove. These binding motifs can be summarized in terms of primary and secondary anchors in the peptide, and used to predict putative CTL epitopes from a pathogen. In this study, we identified the MHC-I binding motifs for four common equine MHC-I alleles, namely Eqca-1*00101, Eqca-N*00101, Eqca-16*00101 and Eqca-1*00201 by eluting and sequencing endogenous peptide binders, and by in vitro binding approaches using positional scanning combinatorial libraries (PSCL). We found these binding motifs to be similar to those of known human MHC-I alleles organized in HLA supertypes. The peptide binding repertoires of Eqca-1*00101 and Eqca-N*00101 with 0.2 % and 0.5 %, respectively, are rather limited compared to 3 % on average for most human and mouse class I alleles. Based on the motifs of the first two alleles, we predicted and identified several high affinity peptides derived from EHV-1, and found peptide RDGARFGEL restricted by Eqca-1*00101 to be immunogenic in ex vivo ELISpot assays. In addition, ELISpot assays were adapted to detect virus-specific T cell activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimulation with replication- competent virus. This method was used to evaluate induction of T cell activity after multiple infections with virulent EHV-1 strains or vaccination with attenuated virus. Detectable T cell frequencies were found only in multiply infected but not in vaccinated horses. The modified ELISpot assay can hopefully provide a reliable tool to correlate virus-specific T cell frequencies with protective immunity against EHV-1-associated diseases of the horse.
Infektionen des Pferds mit dem equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) führen zu Rhinopneumonitis, Aborten in trächtigen Stuten und neurologischen Erkrankungen. Das Virus repliziert primär in Epithelzellen der oberen Atemwege, bevor es via Leukozyten-assoziierter Virämie zu sekundären Infektionsorten (Endothel von Blut- und Lymphgefäßen) transportiert wird. Frequenzen virusspezifischer zytotoxischer T Lymphozyten (CTL) korrelieren eindeutig mit einem Immunschutz, weswegen davon ausgegangen wird, dass die Infektion größtenteils durch CTL-Aktivität kontrolliert wird. Kommerzielle Impfstoffe können hohe virusneutralisierende Antikörpertiter induzieren, ein kompletter Schutz vor Infektion und Erkrankung kann allerdings nur in Pferden beobachtet werden, die mehrmals mit virulenten Stämmen infiziert wurden. CTL erkennen infizierte Zellen, indem sie mit ihrem polymorphen T-Zellrezeptor (TCR) einen Komplex aus Peptiden pathogenen Ursprungs und Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I-Molekülen (MHC-I) auf der Oberfläche der Zelle binden. MHC-I-Moleküle assoziieren mit Peptiden intrazellulären Ursprungs entsprechend ihres Bindemotivs, das durch polymorphe Aminosäurereste in der Bindespalte für Peptide bestimmt wird. Diese Bindemotive können als primäre und sekundäre Ankerreste im Peptid zusammengefasst und zur Vorhersage vermeintlicher CTL-Epitope genutzt werden. In dieser Arbeit wurden die Bindemotive für vier häufige, equine MHC-I-Allele namens Eqca-1*00101, Eqca-N*00101, Eqca-16*00101 und Eqca-1*00201 durch Eluierung und Sequenzierung endogener Peptidliganden sowie in vitro Bindungsstudien mit Hilfe von positional scanning combinatorial libraries (PSCL) identifiziert. Die Bindemotive ähneln denen bekannter humaner MHC-I-Allele, die entsprechend ihrer Spezifitäten in Supertypen zusammengefasst werden können. Die Peptidrepertoires von Eqca-1*00101 und Eqca-N*00101 sind mit 0,2 % bzw. 0,6 % eher limitiert verglichen mit durchschnittlich 3 % für die meisten humanen und murinen Klasse I-Allele. Basierend auf den Motiven für die ersten zwei Allele wurden mehrere, hoch affine Bindepeptide aus dem EHV-1-Proteom vorhergesagt und identifiziert. Das Peptid RDGARFGEL wird von Eqca-1*00101 präsentiert und ist in ex vivo ELISpot Assays immunogen. Zusätzlich wurde der ELISpot Assay adaptiert, um virusspezifische T-Zellaktivität in mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) nach Stimulierung mit replikationskompetentem Virus zu detektieren. Diese Methode wurde angewandt, um die Induzierung der T-Zellantwort nach multiplen Infektionen mit virulenten EHV-1 Stämmen oder Immunisierung mit attenuiertem Virus zu evaluieren. T-Zellfrequenzen waren nur in infizierten aber nicht in geimpften Tieren nachweisbar. Der modifizierte ELISpot Assay wird hoffentlich ein verlässliches System darstellen, mit dem virusspezifische T-Zellfrequenzen mit protektiver Immunität gegen EHV-1-assoziierte Erkrankungen des Pferdes korreliert werden können
