Gene therapy is a promising alternative for the treatment of genetic as well as acquired diseases. Goal of my work was to create a non-viral transposon- based gene delivery vector that could target transposon insertions to “safe” sites in the human which is a prerequisite for “safer” gene therapy. As a transposon tool I chose to use the Sleeping Beauty (SB) System since it is the most profound studied vertebrate DNA transposon to date. The SB transposon system has been applied as delivery tool for therapeutic transgenes for a variety of diseases in a variety of human cell types. To ensure insertion of the transposon into a “safe” site in the human genome, some form of targeting would be desirable. In this work I examined if targeted transposon insertions can be achieved using fusion proteins of a DNA binding domain and the catalytic component of the SB transposon, the transposase. For this two alternative approaches were pursued. First the SB transposase was fused to the articifial six-finger zinc finger (ZF) protein E2C, which binds a single unique site in the human genome. Secondly new six-finger ZF proteins were designed who´s binding domain exist in multiple copies throughout the human genome. Fusion proteins of ZF proteins and SB transposase were tested for their catalytic activity in cell culture transposition and transposon excision PCR assays. Their ability to bind their predicted target sites was examined using luciferase reporter assays. Eligibility for targeted transposon insertion was tested on plasmid level for E2C/SB fusion proteins using a so- called plasmid-to-plasmid assay. Eligibility for targeted transposon insertion in the human genome was tested using site locus-specific PCR for the E2C/SB fusion proteins and Southern blot and LAM-PCR for both approaches. All experiments were done in HeLa cells. Targeting the E2C binding site with the E2C/SB transposase showed some success in plasmid context, however failed in genomic context. In the second approach three six-finger ZF proteins were designed using the “Zinc finger tools” website. Their predicted ZF binding sites lay in the 3´-region of a member of the Ta-subfamily of LINE1 elements. Two of the three ZF proteins (ZF A and ZF B) bound their predicted target site fourfold better than negative controls respectively. Using ZF B/SB transposase fusion proteins an enrichment of transposon insertions near the ZF B binding site could be observed.
Gentherapie stellt eine vielversprechende Alternative zur Behandlung von genetischen und erworbenen Krankheiten dar. Ziel dieser Arbeit ist es, die Möglichkeit zu untersuchen, mit Hilfe von Transposons ein therapeutisches Transgen gezielt an einer „sicheren“ Stelle im menschlichen Genom einzubauen, um so eine Grundlage für eine „sicherere“ Gentherapie zu schaffen. Als Transposon wurde das Sleeping Beauty (SB) Transposon System gewählt, da es das zur Zeit am intensivsten untersuchte DNA Transposon in Vertebraten ist. Das SB Transposon wurde bereits bei einer Vielfalt unterschiedlicher Krankheiten in unterschiedlichen menschlichen Zelltypen als Vektor-System erfolgreich getestet. Um sicherzustellen, dass das SB Transposon an einer „sicheren“ Stelle im menschlichen Genom inseriert, ist ein gezielter Einbau des Transposons notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob durch eine Fusion zwischen der enzymatischen Komponente des SB Transposon Systems, der Transposase, mit einer DNA-Bindedomäne ein gezielter Einbau des Transposons herbeigeführt werden kann. Hierzu wurden zwei alternative Ansätze verfolgt, zum einem wurde die SB Transposase mit dem artifiziellen sechs- Finger Zinkfingerprotein (ZFP) E2C, dessen Bindestelle ein einziges Mal im menschlichen Genom vorkommt, fusioniert und zum anderen neue sechs-Finger ZFPe erschaffen und getestet, deren Bindestellen mehrfach im menschlichen Genom zu finden sind. Fusionsproteine aus ZFP und SB Transposase wurden auf ihre katalytischen Fähigkeiten mit Hilfe von Transpositions- und Transposon Excisionsassay getestet. Ihr Bindevermögen wurde mit Hilfe von Luciferase Reporterassays überprüft. Ihre Eignung für den gezielten Einbau von Transgenen wurde zunächst auf Plasmidebene für E2C/SB Fusionsproteine unter Anwendung eines sogenannten Plasmid-zu-Plasmidassays untersucht. Gezielter Einbau im menschlichen Genom wurde mit Hilfe von locus-spezifischer PCR für E2C/SB Fusionsproteine und Southern Blot und LAM-PCR für beide Ansätze überpüft. Alle Untersuchungen wurden in HeLa Zellen durchgeführt. Für die E2C/SB Fusionsproteine konnte eine veränderte Verteilung der Transposonsinsertionen auf Plasmidebene gezeigt werden, jedoch nicht im Kontext des menschlichen Genoms. Die drei, in dem zweiten Ansatz getesteten, sechs-Finger ZFPe wurden mit Hilfe der „Zinc finger tools“ Internetseite erschaffen. Ihre prognostizierten Bindedomänen lagen in der 3´-Region der Ta Unterfamilie von LINE1 Elementen im menschlichen Genom. Zwei der drei ZFPe (A und B) banden ihre prognostizierte Bindedomäne in Luciferase Reporterassays vierfach besser als entsprechende Negativkontrollen. Mit Hilfe eines Fusionsproteins aus ZFP B und der SB Transposase konnte eine Anreicherung von SB Transposon Insertionen in derNähe der ZFP B Bindedomäne im menschlichen Genom nachgewiesen werden.
