Die Mutationen in den Genen von Membranproteinen fuehren haeufig zu fehlgefalteten Proteinvarianten, die von einem Qualitaetskontrollsystem im fruehen sekretorischen Weg erkannt und retiniert werden. Resultate solcher Mutationen sind oft Ursache fuer vererbbare Krankheiten. Defekte Vasopressin-V2-Rezeptoren (V2R) koennen beispielsweise zu nephrogenem Diabetes Insipidus fuehren. Einen Ansatzpunkt fuer die Behandlung dieser Krankheiten stellen pharmakologische Chaperone dar, die den Faltungsprozess verbessern und dadurch den Transport der Rezeptormutanten zur Zellmembran unterstuetzen. Im Fall des V2R wurde der Antagonist SR121463B als pharmakologisches Chaperon beschrieben. SR121463B bindet mit hoher Affinitaet an den Rezeptor und blockiert die Bindungsstelle des natuerlichen Agonisten 8-Arginin-Vasopressin (AVP). Dadurch wird die Faltung erleichtert und die Rezeptoren koennen besser zur Zellmembran transportiert werden. Aufgrund der hohen Affinitaet von SR121463B und dessen nahezu irreversible Bindung koennen die mutierten Rezeptoren an der Zellmembran nicht mehr durch AVP aktiviert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein High Throughput Screening (HTS) Verfahren entwickelt, mit dem Ziel, neue Substanzen zu identifizieren, die den Transport von faltungs- und transportdefekten V2R-Mutanten an die Zellmembran verbessern. Mittels dieses HTS wurde eine Bibliothek von ueber 17.500 Substanzen analysiert. Eine identifizierte Hitsubstanz war in der Lage, den Transport der L336T-Mutante des V2R an die Zellmembran stark zu steigern. Die im Rahmen der Entwicklung des HTS-Assays etablierte automatische Mikroskopie wurde auch dazu genutzt, Transportstudien an anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durchzufuehren, beispielsweise an Corticotropin-Releasing-Factor- Rezeptoren. Bisher war ungeklaert, ob pharmakologische Chaperone co- und/oder post-translational wirken. Um dieses zu untersuchen, wurden im zweiten Teil der Arbeit Fusionen des wildtypischen V2R und der fehlgefalteten Rezeptormutanten S167T und R337X mit dem photokonvertierbaren Fluoreszenzprotein mKikGR hergestellt. Mit Hilfe eines neu etablierten zellbasierten Assays wurde nachgewiesen, dass SR121463B sowohl co- als auch post-translational wirken kann.
Mutations in the genes encoding for membrane proteins lead to misfolded protein forms that are recognized by a quality control system in the early secretory pathway. Misfolded proteins are usually retained intracellularly and may cause inherited diseases. In the case of the vasopressin V2 receptor (V2R) mutations may cause nephrogenic diabetes insipidus. A pharmacological approach to treat diseases where misfolded proteins play a role involves the use of pharmacological chaperones, which bind specifically to the native proteins, improve protein folding and consequently rescue the transport of the mutant receptors to the cell membrane. For the V2R, the antagonist SR121463B has been described as a pharmacological chaperone. SR121463B binds with very high affinity (i.e. almost irreversibly) to the receptor, with the consequence that the natural ligand 8-arginin-vasopressin (AVP) can not activate rescued receptors because the ligand binding pocket is blocked. In the present study, a high throughput screening assay (HTS) based on automated microscopy was developed in order to identify novel compounds which are able to rescue the trafficking of misfolded and transport defective V2R-mutants to the cell membrane. Using this HTS assay, a library containing over 17,500 compounds was analysed. One hit compound was found which was able to rescue significantly the transport of the L336T mutant of the V2R to the cell membrane. In various cooperations, the HTS assay was also used to analyze trafficking of other GPCRs such as corticotropin releasing factor receptors. To date, it was not completely clear whether pharmacological chaperones act co or post- translationally. In order to address this question, fusions of the wild type V2R and its misfolded receptor mutants S167T and R337X were generated with the photoconvertible fluorescent protein mKikGR in the second part of this study. By using a novel cell-based assay using mKikGR, it could be shown that the pharmacological chaperone SR1214363B can act co- as well as post- translationally.
