dc.contributor.author
Ridelis, Ingrid
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:55:39Z
dc.date.available
2012-09-04T09:59:23.791Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7153
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11352
dc.description.abstract
Die Mutationen in den Genen von Membranproteinen fuehren haeufig zu
fehlgefalteten Proteinvarianten, die von einem Qualitaetskontrollsystem im
fruehen sekretorischen Weg erkannt und retiniert werden. Resultate solcher
Mutationen sind oft Ursache fuer vererbbare Krankheiten. Defekte
Vasopressin-V2-Rezeptoren (V2R) koennen beispielsweise zu nephrogenem Diabetes
Insipidus fuehren. Einen Ansatzpunkt fuer die Behandlung dieser Krankheiten
stellen pharmakologische Chaperone dar, die den Faltungsprozess verbessern und
dadurch den Transport der Rezeptormutanten zur Zellmembran unterstuetzen. Im
Fall des V2R wurde der Antagonist SR121463B als pharmakologisches Chaperon
beschrieben. SR121463B bindet mit hoher Affinitaet an den Rezeptor und
blockiert die Bindungsstelle des natuerlichen Agonisten 8-Arginin-Vasopressin
(AVP). Dadurch wird die Faltung erleichtert und die Rezeptoren koennen besser
zur Zellmembran transportiert werden. Aufgrund der hohen Affinitaet von
SR121463B und dessen nahezu irreversible Bindung koennen die mutierten
Rezeptoren an der Zellmembran nicht mehr durch AVP aktiviert werden. In der
vorliegenden Arbeit wurde ein High Throughput Screening (HTS) Verfahren
entwickelt, mit dem Ziel, neue Substanzen zu identifizieren, die den Transport
von faltungs- und transportdefekten V2R-Mutanten an die Zellmembran
verbessern. Mittels dieses HTS wurde eine Bibliothek von ueber 17.500
Substanzen analysiert. Eine identifizierte Hitsubstanz war in der Lage, den
Transport der L336T-Mutante des V2R an die Zellmembran stark zu steigern. Die
im Rahmen der Entwicklung des HTS-Assays etablierte automatische Mikroskopie
wurde auch dazu genutzt, Transportstudien an anderen G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren durchzufuehren, beispielsweise an Corticotropin-Releasing-Factor-
Rezeptoren. Bisher war ungeklaert, ob pharmakologische Chaperone co- und/oder
post-translational wirken. Um dieses zu untersuchen, wurden im zweiten Teil
der Arbeit Fusionen des wildtypischen V2R und der fehlgefalteten
Rezeptormutanten S167T und R337X mit dem photokonvertierbaren
Fluoreszenzprotein mKikGR hergestellt. Mit Hilfe eines neu etablierten
zellbasierten Assays wurde nachgewiesen, dass SR121463B sowohl co- als auch
post-translational wirken kann.
de
dc.description.abstract
Mutations in the genes encoding for membrane proteins lead to misfolded
protein forms that are recognized by a quality control system in the early
secretory pathway. Misfolded proteins are usually retained intracellularly and
may cause inherited diseases. In the case of the vasopressin V2 receptor (V2R)
mutations may cause nephrogenic diabetes insipidus. A pharmacological approach
to treat diseases where misfolded proteins play a role involves the use of
pharmacological chaperones, which bind specifically to the native proteins,
improve protein folding and consequently rescue the transport of the mutant
receptors to the cell membrane. For the V2R, the antagonist SR121463B has been
described as a pharmacological chaperone. SR121463B binds with very high
affinity (i.e. almost irreversibly) to the receptor, with the consequence that
the natural ligand 8-arginin-vasopressin (AVP) can not activate rescued
receptors because the ligand binding pocket is blocked. In the present study,
a high throughput screening assay (HTS) based on automated microscopy was
developed in order to identify novel compounds which are able to rescue the
trafficking of misfolded and transport defective V2R-mutants to the cell
membrane. Using this HTS assay, a library containing over 17,500 compounds was
analysed. One hit compound was found which was able to rescue significantly
the transport of the L336T mutant of the V2R to the cell membrane. In various
cooperations, the HTS assay was also used to analyze trafficking of other
GPCRs such as corticotropin releasing factor receptors. To date, it was not
completely clear whether pharmacological chaperones act co or post-
translationally. In order to address this question, fusions of the wild type
V2R and its misfolded receptor mutants S167T and R337X were generated with the
photoconvertible fluorescent protein mKikGR in the second part of this study.
By using a novel cell-based assay using mKikGR, it could be shown that the
pharmacological chaperone SR1214363B can act co- as well as post-
translationally.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Automated microscopy
dc.subject
G protein-coupled receptors
dc.subject
vasopressin V2 receptor
dc.subject
pharmacological chaperone
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Analyse des intrazellulaeren Transports von fehlgefalteten Varianten des
Vasopressin-V2-Rezeptors
dc.contributor.contact
ingrid-ridelis@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. W. Rosenthal
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. G. P. Pueschel
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. H. Biebermann
dc.date.accepted
2012-09-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038539-9
dc.title.translated
Analysis of the intracellular transport of misfolded vasopressin V2 receptors
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000038539
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011786
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access