Zielsetzung der Arbeiten war es, die Bedeutung von extrazellulärer Matrix, Kaliumkanälen sowie eines Lindera obtusiloba Extraktes bzw. daraus isoliertem (+)-Episesamin für eine mögliche Beeinflussung von Fibrose, Inflammation und Neoplasie zu untersuchen. Die Arbeiten zeigten, dass Kollagene und Kollagenfragmente, als Hauptbestandteil fibrotischer Matrix, inaktive Proformen von Matrix-Metalloproteinasen (ProMMPs) speichern und zelluläre Prozesse wie Proliferation und Differenzierung beeinflussen. Die tripelhelikale Kollagensequenz „(Glycin-Prolin-Hydroxyprolin)n“ - (GPO)n - wurde als Konsensusbindungsstelle für ProMMPs identifiziert. Mit dem daraus abgeleiteten synthetischen Kollagenpeptid (GPO)10 konnte die Kollagenbindung der Gelatinasen ProMMP-2 und -9 geschwächt bzw. gebundene Gelatinasen freigesetzt und im Fall von ProMMP-2 aktiviert werden. Dies führte in vitro zu verstärkter Proliferation und Invasion von hepatischen Sternzellen (HSZ) und Tumorzellen aufgrund erhöhter Verfügbarkeit von aktiviertem MMP-2. Neben der Leberfibrose werden MMP-2 und -9 auch im Darm exprimiert und sind dort an der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Darmepithels beteiligt. Im akuten Modell der murinen DSS-Colitis zeigte (GPO)10 neben anti- inflammatorischen Effekten auch protektive Effekte gegenüber der strukturellen Zerstörung des Darmepithels, wahrscheinlich durch Freisetzung und Aktivierung von Epithel-protektiver MMP-2 sowie durch Freisetzung, aber keiner Aktivierung von Epithel-schädigender MMP-9. Mit der tripelhelikalen Domäne der alpha 2-Kette von Kollagen VI wurde ein weiteres Matrixfragment identifiziert, welches die Matrixbindung und enzymatische Aktivität vor allem der Kollagenasen hemmte, die Gelatinase ProMMP-2 dagegen aktivierte und vor Autodegradation schützte. Aus pathophysiologischer Sicht wird bei der Fibrose die lokale, Matrix-abbauende Wirkung der MMPs durch überschüssiges Kollagen neutralisiert, so dass Kollagene akkumulieren. Durch gezielte Beeinflussung dieser lokalen MMP-Matrix-Interaktion, z.B. durch Freisetzung von MMPs mit o.g. MMP-spezifisch wirksamen Peptiden, ist ein lokal wirkender, fibrolytischer Stimulus denkbar. Neben der Matrix befassten sich komplementäre Studien auf Zellebene mit der Expression und den Auswirkungen einer Inhibition von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen mit mittlerer Leitfähigkeit (KCa3.1) auf die Fibrose. Erstmals wurde eine KCa3.1-Expression vor allem in aktivierten HSZ sowie in humanen, fibrotischen Lebergewebsproben gezeigt. In quieszenten HSZ und gesundem Lebergewebe dagegen wurden KCa3.1 nicht bzw. nur schwach exprimiert. Eine KCa3.1-Inhibition mit dem spezifischen Inhibitor TRAM-34 hemmte zum einen die HSZ-Proliferation durch Induktion eines Zellzyklusarrestes und zum anderen die TGF-β1-Signaltransduktion in HSZ, einem wichtigen, fibrogenen Signalweg. Im Rattenmodell der durch Gallengangsligation induzierten Leberfibrose reduzierte TRAM-34 den Fibrose-fördernden portalen Druck, was Effekte von KCa3.1 auf die Kontraktion der Gefäßzellen impliziert. TRAM-34 zeigte auch anti-neoplastisches Potential in humanen Zelllinien des HCC, u.a. durch Hemmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB, welcher beim HCC durch spontane Aktivierung als Überlebensfaktor gilt, und durch verminderte ERα-Expression. TRAM-34 ist physiologisch gut verträglich, was besonders bei eingeschränkter Leberfunktion, z.B. bei vorliegender Zirrhose als Vorerkrankung des HCC, von Bedeutung sein kann. Jüngere eigene Arbeiten weisen zudem auf eine Beteiligung von KCa3.1 bei der Kalzifizierung glatter Gefäßmuskelzellen hin, welche durch TRAM-34 gehemmt wurde. Weitere Studien auf Zellebene befassten sich mit der Wirkung pflanzlicher Wirkstoffe auf Fibrose und Neoplasie. Im in vitro-Modell der Leberfibrose mit HSZ hemmte das Lindera obtusiloba Extrakt die Proliferation sowie die TGF-β1-induzierte Expression fibrogener Marker wie Kollagen I und inhibierte der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. In humanen HCC-Zelllinien zeigte das Extrakt anti-mitogene Effekte, einhergehend mit der Induktion von Apoptose sowie der Hemmung der IGF-1-Signaltransduktion und von NF-ĸB. Mit (+)-Episesamin wurde ein pharmakologisch wirksamer Inhaltsstoff aus dem Extrakt isoliert und dessen absolute Konfiguration erstmals beschrieben. Ähnlich wie das Extrakt, zeigte (+)-Episesamin durch Hemmung von Proliferation und dem TGF-β1-Signalweg ebenfalls anti-fibrotische Effekte in HSZ. Zum anderen auch anti-neoplastische Effekte in HCC-Zelllinien durch MMP-Inhibition sowie durch Hemmung von Proliferation, NF-ĸB und der VEGF-Sekretion. Anti-inflammatorische Effekte von (+)-Episesamin wurden in Tumorzellen und Makrophagen durch Hemmung TNF-- und LPS-induzierter IL-6-Sekretion sowie durch Hemmung der TNF-- und PDGF- induzierten Aktivierung glatter Gefäßmuskelzellen gezeigt. Wie in Abbildung 5 schematisch dargestellt, beschreiben die hier vorgestellten Untersuchungen zur Pathogenese von Fibrose und Karzinogenese zusammengefasst potentielle Möglichkeiten ihrer Beeinflussung auf Matrix- und Zellebene. Die Ergebnisse stellen eine Rationale für weitere Untersuchungen in spezifischen Tiermodellen dar, wobei auch die Kombination von Matrix- (z.B. (GPO)10) und zellspezifischen Ansätzen (z.B. TRAM-34) denkbar ist.
Aim of this work was to identify potential therapeutic tools to impact fibrosis, inflammation and neoplasia. Effects of extracellular matrix (ECM) components, ion channel inhibitors and an extract from Lindera obtusiloba were studied. We showed that collagens and collagen fragments store inactive proforms of matrix-metalloproteinases (proMMPs). The triplehelical collagen sequence Gly-Pro-Hyp (GPO) was identified as consensus binding motif. The related collagen peptide (GPO)10 interfered with the collagen binding of the gelatinases proMMP-2 and -9 and induced enzymatically activation of proMMP-2. In vitro, (GPO)10 induced proliferation and invasion of hepatic stellate cells (HSC) and tumor cells, respectively, due to a higher amount of active MMP-2. In an acute murine model of DSS-colitis, (GPO)10 protected the epithelial barrier from DSS-induced disruption and showed anti-inflammatory activity. This might be due to a release and activation of matrix bound epithelial- protective (pro)MMP-2 and due to a release of epithelial-damaging (pro)MMP-9 (without activation of proMMP-9). Another identified ecm fragment was the triplehelical domain of the alpha 2-chain of collagen VI. The alpha 2-chain interfered with the collagen binding and activity of the collagenases MMP-1, MMP-8 and MMP-13. In addition, the alpha 2-chain activated the gelatinase proMMP-2 and protected it from auto-degradion. In summary, the results indicate that the local matrix degrading activity of MMPs is neutralized by excess amounts of collagens. A targeted modulation of this local MMP-ECM interaction e.g. by (GPO)10, might induce a fibrolytic stimulus. Besides the ECM, expressions of intermediate conductance calcium-activated potassium channels (KCa3.1) and effects of the KCa3.1-inhibitor TRAM-34 on fibrosis were studied. We showed that fibrotic tissues and TGF-beta1-activated HSC exhibited higher KCa3.1-expressions than normal tissue and untreated cells. KCa3.1 inhibition with TRAM-34 reduced HSC proliferation by induction of cell cycle arrest and reduced TGF-beta1-induced gene expression of collagen I, alpha- smooth muscle actin and TGF-beta1 itself. Furthermore, TRAM-34 blocked TGF- beta1-induced activation of TGF-b signalling in HSC. In vivo, TRAM-34 reduced the thromboxane agonist-induced portal perfusion pressure. We conclude that inhibition of KCa3.1 with TRAM-34 downregulates fibrosis-associated gene expression in vitro, and reduces portal perfusion pressure in vivo. Thus, KCa3.1 may represent novel targets for the treatment of liver fibrosis. TRAM-34 also showed anti-neoplastic effects in human hepatocellular carcinoma cell lines by inhibition of the transcription factor NF-ĸB and by reduced expression of the estrogen receptor alpha. Further studies investigated effects of natural drugs on fibrosis and neoplasia. An extract from Lindera obtusiloba (LOE) showed protective effects in in vitro models of liver fibrosis and HCC in vitro. (+)-Episesamin was identified as an active drug in LOE. (+)-Episesamin showed the same protective effects on fibrosis and neoplasia as LOE. In summary, the results suggest further studies in specific animal models.
