dc.contributor.author
Freise, Christian
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:07:43Z
dc.date.available
2015-11-20T10:19:35.156Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6637
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10836
dc.description.abstract
Zielsetzung der Arbeiten war es, die Bedeutung von extrazellulärer Matrix,
Kaliumkanälen sowie eines Lindera obtusiloba Extraktes bzw. daraus isoliertem
(+)-Episesamin für eine mögliche Beeinflussung von Fibrose, Inflammation und
Neoplasie zu untersuchen. Die Arbeiten zeigten, dass Kollagene und
Kollagenfragmente, als Hauptbestandteil fibrotischer Matrix, inaktive
Proformen von Matrix-Metalloproteinasen (ProMMPs) speichern und zelluläre
Prozesse wie Proliferation und Differenzierung beeinflussen. Die
tripelhelikale Kollagensequenz „(Glycin-Prolin-Hydroxyprolin)n“ - (GPO)n -
wurde als Konsensusbindungsstelle für ProMMPs identifiziert. Mit dem daraus
abgeleiteten synthetischen Kollagenpeptid (GPO)10 konnte die Kollagenbindung
der Gelatinasen ProMMP-2 und -9 geschwächt bzw. gebundene Gelatinasen
freigesetzt und im Fall von ProMMP-2 aktiviert werden. Dies führte in vitro zu
verstärkter Proliferation und Invasion von hepatischen Sternzellen (HSZ) und
Tumorzellen aufgrund erhöhter Verfügbarkeit von aktiviertem MMP-2. Neben der
Leberfibrose werden MMP-2 und -9 auch im Darm exprimiert und sind dort an der
Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Darmepithels beteiligt. Im
akuten Modell der murinen DSS-Colitis zeigte (GPO)10 neben anti-
inflammatorischen Effekten auch protektive Effekte gegenüber der strukturellen
Zerstörung des Darmepithels, wahrscheinlich durch Freisetzung und Aktivierung
von Epithel-protektiver MMP-2 sowie durch Freisetzung, aber keiner Aktivierung
von Epithel-schädigender MMP-9. Mit der tripelhelikalen Domäne der alpha
2-Kette von Kollagen VI wurde ein weiteres Matrixfragment identifiziert,
welches die Matrixbindung und enzymatische Aktivität vor allem der
Kollagenasen hemmte, die Gelatinase ProMMP-2 dagegen aktivierte und vor
Autodegradation schützte. Aus pathophysiologischer Sicht wird bei der Fibrose
die lokale, Matrix-abbauende Wirkung der MMPs durch überschüssiges Kollagen
neutralisiert, so dass Kollagene akkumulieren. Durch gezielte Beeinflussung
dieser lokalen MMP-Matrix-Interaktion, z.B. durch Freisetzung von MMPs mit
o.g. MMP-spezifisch wirksamen Peptiden, ist ein lokal wirkender,
fibrolytischer Stimulus denkbar. Neben der Matrix befassten sich komplementäre
Studien auf Zellebene mit der Expression und den Auswirkungen einer Inhibition
von Kalzium-aktivierten Kaliumkanälen mit mittlerer Leitfähigkeit (KCa3.1) auf
die Fibrose. Erstmals wurde eine KCa3.1-Expression vor allem in aktivierten
HSZ sowie in humanen, fibrotischen Lebergewebsproben gezeigt. In quieszenten
HSZ und gesundem Lebergewebe dagegen wurden KCa3.1 nicht bzw. nur schwach
exprimiert. Eine KCa3.1-Inhibition mit dem spezifischen Inhibitor TRAM-34
hemmte zum einen die HSZ-Proliferation durch Induktion eines
Zellzyklusarrestes und zum anderen die TGF-β1-Signaltransduktion in HSZ, einem
wichtigen, fibrogenen Signalweg. Im Rattenmodell der durch Gallengangsligation
induzierten Leberfibrose reduzierte TRAM-34 den Fibrose-fördernden portalen
Druck, was Effekte von KCa3.1 auf die Kontraktion der Gefäßzellen impliziert.
TRAM-34 zeigte auch anti-neoplastisches Potential in humanen Zelllinien des
HCC, u.a. durch Hemmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB,
welcher beim HCC durch spontane Aktivierung als Überlebensfaktor gilt, und
durch verminderte ERα-Expression. TRAM-34 ist physiologisch gut verträglich,
was besonders bei eingeschränkter Leberfunktion, z.B. bei vorliegender
Zirrhose als Vorerkrankung des HCC, von Bedeutung sein kann. Jüngere eigene
Arbeiten weisen zudem auf eine Beteiligung von KCa3.1 bei der Kalzifizierung
glatter Gefäßmuskelzellen hin, welche durch TRAM-34 gehemmt wurde. Weitere
Studien auf Zellebene befassten sich mit der Wirkung pflanzlicher Wirkstoffe
auf Fibrose und Neoplasie. Im in vitro-Modell der Leberfibrose mit HSZ hemmte
das Lindera obtusiloba Extrakt die Proliferation sowie die TGF-β1-induzierte
Expression fibrogener Marker wie Kollagen I und inhibierte der Bildung
reaktiver Sauerstoffradikale. In humanen HCC-Zelllinien zeigte das Extrakt
anti-mitogene Effekte, einhergehend mit der Induktion von Apoptose sowie der
Hemmung der IGF-1-Signaltransduktion und von NF-ĸB. Mit (+)-Episesamin wurde
ein pharmakologisch wirksamer Inhaltsstoff aus dem Extrakt isoliert und dessen
absolute Konfiguration erstmals beschrieben. Ähnlich wie das Extrakt, zeigte
(+)-Episesamin durch Hemmung von Proliferation und dem TGF-β1-Signalweg
ebenfalls anti-fibrotische Effekte in HSZ. Zum anderen auch anti-neoplastische
Effekte in HCC-Zelllinien durch MMP-Inhibition sowie durch Hemmung von
Proliferation, NF-ĸB und der VEGF-Sekretion. Anti-inflammatorische Effekte von
(+)-Episesamin wurden in Tumorzellen und Makrophagen durch Hemmung TNF-- und
LPS-induzierter IL-6-Sekretion sowie durch Hemmung der TNF-- und PDGF-
induzierten Aktivierung glatter Gefäßmuskelzellen gezeigt. Wie in Abbildung 5
schematisch dargestellt, beschreiben die hier vorgestellten Untersuchungen zur
Pathogenese von Fibrose und Karzinogenese zusammengefasst potentielle
Möglichkeiten ihrer Beeinflussung auf Matrix- und Zellebene. Die Ergebnisse
stellen eine Rationale für weitere Untersuchungen in spezifischen Tiermodellen
dar, wobei auch die Kombination von Matrix- (z.B. (GPO)10) und
zellspezifischen Ansätzen (z.B. TRAM-34) denkbar ist.
de
dc.description.abstract
Aim of this work was to identify potential therapeutic tools to impact
fibrosis, inflammation and neoplasia. Effects of extracellular matrix (ECM)
components, ion channel inhibitors and an extract from Lindera obtusiloba were
studied. We showed that collagens and collagen fragments store inactive
proforms of matrix-metalloproteinases (proMMPs). The triplehelical collagen
sequence Gly-Pro-Hyp (GPO) was identified as consensus binding motif. The
related collagen peptide (GPO)10 interfered with the collagen binding of the
gelatinases proMMP-2 and -9 and induced enzymatically activation of proMMP-2.
In vitro, (GPO)10 induced proliferation and invasion of hepatic stellate cells
(HSC) and tumor cells, respectively, due to a higher amount of active MMP-2.
In an acute murine model of DSS-colitis, (GPO)10 protected the epithelial
barrier from DSS-induced disruption and showed anti-inflammatory activity.
This might be due to a release and activation of matrix bound epithelial-
protective (pro)MMP-2 and due to a release of epithelial-damaging (pro)MMP-9
(without activation of proMMP-9). Another identified ecm fragment was the
triplehelical domain of the alpha 2-chain of collagen VI. The alpha 2-chain
interfered with the collagen binding and activity of the collagenases MMP-1,
MMP-8 and MMP-13. In addition, the alpha 2-chain activated the gelatinase
proMMP-2 and protected it from auto-degradion. In summary, the results
indicate that the local matrix degrading activity of MMPs is neutralized by
excess amounts of collagens. A targeted modulation of this local MMP-ECM
interaction e.g. by (GPO)10, might induce a fibrolytic stimulus. Besides the
ECM, expressions of intermediate conductance calcium-activated potassium
channels (KCa3.1) and effects of the KCa3.1-inhibitor TRAM-34 on fibrosis were
studied. We showed that fibrotic tissues and TGF-beta1-activated HSC exhibited
higher KCa3.1-expressions than normal tissue and untreated cells. KCa3.1
inhibition with TRAM-34 reduced HSC proliferation by induction of cell cycle
arrest and reduced TGF-beta1-induced gene expression of collagen I, alpha-
smooth muscle actin and TGF-beta1 itself. Furthermore, TRAM-34 blocked TGF-
beta1-induced activation of TGF-b signalling in HSC. In vivo, TRAM-34 reduced
the thromboxane agonist-induced portal perfusion pressure. We conclude that
inhibition of KCa3.1 with TRAM-34 downregulates fibrosis-associated gene
expression in vitro, and reduces portal perfusion pressure in vivo. Thus,
KCa3.1 may represent novel targets for the treatment of liver fibrosis.
TRAM-34 also showed anti-neoplastic effects in human hepatocellular carcinoma
cell lines by inhibition of the transcription factor NF-ĸB and by reduced
expression of the estrogen receptor alpha. Further studies investigated
effects of natural drugs on fibrosis and neoplasia. An extract from Lindera
obtusiloba (LOE) showed protective effects in in vitro models of liver
fibrosis and HCC in vitro. (+)-Episesamin was identified as an active drug in
LOE. (+)-Episesamin showed the same protective effects on fibrosis and
neoplasia as LOE. In summary, the results suggest further studies in specific
animal models.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
liver fibrosis
dc.subject
extracellular matrix
dc.subject
hepatocellular carcinoma
dc.subject
Lindera obtusiloba
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Bedeutung und mögliche therapeutische Nutzung von Komponenten der
extrazellulären Matrix, KCa3.1-Ionenkanälen und Lindera obtusiloba bei
Leberfibrose und dem hepatozellulären Karzinom
dc.contributor.contact
christian.freise@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. Elke Roeb
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. Jochen Hampel
dc.date.accepted
2015-11-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100698-1
dc.title.translated
Implication and potential therapeutic utilization of extracellular matrix
components, KCa3.1 ion channels and Lindera obtusiloba for liver fibrosis and
hepatocellular carcinoma
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100698
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018170
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free
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open access