Leishmaniasis is a prevalent disease in many parts of the tropical and subtropical world, causing significant morbidity or mortality. The rapid emergence of drug resistance by the treatment of parasites with common chemotherapeutics requires the development of new drugs for future therapy. Besides rational drug design, natural product research shows promise in finding new lead structures. Plants are valuable sources for the screening of bioactive secondary metabolites. Active compounds can be discovered successfully using modern biological screening assays and subsequent structural modifications can improve the therapeutic profile of lead substances. In the present study we have investigated in vitro activity of some selected plants including Drosera madagascariensis, Drosera peltata, Spathodea campanulata, Tabebuia avellanedae and Juglans regia against both extracellular promastigotes and intracellular amastigotes of Leishmania major GFP. In parallel, the cytotoxic effects against bone marrow-derived macrophages as a mammalian host cell control were evaluated. In addition, a series of naphthoquinones was tested to gain insight into structure-activity relationships with a closer view on their mode of action. The antileishmanial activity of D. madagascariensis was mainly attributed to 7-methyljuglone and quercetin, whereas plumbagin was the most active principal component of D. peltata. Ursolic acid and spathoside were apparently the most active compounds of S. campanulata. A bio-guided fractionation of the most active extract of T. avellanedae led to identification of lapachol and a mixture of isomeric furanonaphthoquinones [5-hydroxy- and 8-hydroxy-2-(1'- hydroxyethyl)naphtho[2,3-b]furan-4,9-diones] as constituents predominantly responsible for the observed antileishmanial activities. Phenolic substances and terpenes which appeared enriched in J. regia leaves may be putative candidates as antileishmanial agents. Regarding the tested series of naphthoquinones, most of the compounds exhibited noticeable leishmanlacidal activity against promastigotes (IC50 0.5 to 6 μM) and intracellular amastigotes (IC50 1 to 7μM) when compared with the antileishmanial drug amphotericin B (IC50 of 2.5 and 0.2μM, respectively). In general, host cell cytotoxicity and antiprotozoal activity seemed to increase in parallel. Conspicuously, the cytotoxic effect was less pronounced on infected host cells compared with that on noninfected cells. Concerning structure-activity relationships for the tested naphthoquinones, some interesting structural features emerged from this study. Introduction of a methyl or methoxyl group at C-2 of the parent 1,4-naphthoquinone slightly increased the leishmaniacidal activity, while the presence of a hydroxyl function in this position dramatically reduced the effectiveness. In contrast, hydroxylation at C-5 and dihydroxy substitution at C-5 and C-8 appear to increase the antileishmanial activity, while the presence of hydroxyl groups in the quinone entity decrease dramatically the efficacy. Similarly, the presence of a side chain hydroxyl group peri to a carbonyl function as represented in the series of shikonin/alkannin derivatives increased the activity when compared with substituted analogs. Since furanonaphthoquinones tested were more active than corresponding naphthoquinones, it appears as if the presence of a furan ring increases the antileishmanial activity of naphthoquinones. Within the series of compounds tested, the dimeric mixture of vaforhizin and isovaforhizin showed the highest activity in vitro against intracellular amastigotes with an IC50 of 1.1 μM. The shikonin/alkannin derivatives proved to be similarly considerably leishmanicidal with IC50 values ranging from 1 to 3 μM. None of the naphthoquinones tested was capable to induce NO production known to play a crucial role in the host resistance against intracellular pathogens, excluding activation of microbicidal mechanisms in macrophages. The mode of action apparently depended on the nature and position of substituents, associated with the electrophilicity of the naphthoquinone or the efficiency of redox cycling. Conspicuously, members oxygenated in the quinone ring proved to be leishmanicidal when coincubated with glutathione, while the majority of the remaining compounds produced inactive glutathione-naphthoquinone conjugates.
Leishmaniose ist eine verbreitete Krankheit in vielen Teilen der tropischen und subtropischen Welt mit einer hohen Erkrankungs- und Sterblichkeitsrate. Die rasche Selektion resistenter Parasiten gegenüber gängigen Chemotherapeutika macht die Entwicklung neuer Arzneimittel für zukünftige Therapien erforderlich. Neben dem strukturbasierten Drug Design ist die Naturstoff-Forschung eine vielversprechende Alternative bei der Suche nach neuen Leitstrukturen für innovative Arzneimittel. Pflanzen sind eine wertvolle Quelle für bioaktive sekundäre Metaboliten. Für das Auffinden von Wirkstoffen sind moderne biologische Screening Tests bestens geeignet. Mit strukturellen Modifikationen kann anschließend das therapeutische Profil von aufgefundenen Leitsubstanzen verbessert werden. In der vorliegenden Studie haben wir einige ausgewählte Pflanzen (Drosera madagascariensis, Drosera peltata, Spathodea campanulata, Tabebuia avellanedae und Juglans regia) auf ihr antileishmanielles Potenzial gegenüber extrazellulären Promastigoten und intrazellulären Amastigoten von transgenen Leishmania major GFP untersucht. Parallel dazu wurden die Extrakte auf zytotoxische Effekte gegenüber Knochenmarksmakrophagen als Wirtszellen getestet. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Naphthochinonen getestet, um Einblick sowohl in Struktur-Wirkungs- Beziehungen als auch Wirkmechanismen zu erhalten. Die antileishmanielle Aktivität von Drosera madagascariensis beruhte hauptsächlich auf 7-Methyljuglone und Quercetin, während Plumbagin der aktivste Hauptbestandteil von Drosera peltata war. Ursolsäure und Spathosid waren offensichtlich die aktivsten Verbindungen von Spathodea campanulata. Eine wirkungsorientierte Fraktionierung (Bioassay guided fractionation) der aktivsten Fraktion aus Tabebuia avellanedae führte zur Identifizierung von Lapachol und einer Mischung von isomeren Furanonaphthoquinonen [5- Hydroxy- und 8-Hydroxy-2-(1'-hydroxyethyl)naphtho[2,3-b]Furan-4,9-diones] als wesentliche Inhaltsstoffe für die beobachtete antileishmanielle Aktivität. Phenolische Verbindungen und Terpene, welche in Juglans regia Blättern angereichert vorliegen, wurden in dieser pflanzlichen Quelle als mögliche antileishmanielle Wirksubstanzen ausgemacht. In der Reihe der getesteten Naphthochinone zeigten die meisten Verbindungen eine deutliche antileishmanielle Aktivität gegen Promastigoten (IC50 0,5 bis 6 μM) und intrazellulären Amastigoten (IC50 1 bis 7μM) im Vergleich zu Amphotericin B (IC50 2,5 bzw. 0,2 μM) als Positivkontrolle. Im Allgemeinen schien die Zytotoxizität mit der antiparasitären Aktivität parallel anzusteigen. Auffälliger Weise war die zytotoxische Wirkung weniger stark ausgeprägt bei infizierten Wirtszellen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen. Einige interessante Struktur-Wirkungs- Beziehungen resultierten aus der Reihe der getesteten Naphthochinone in dieser Studie. Die Einführung einer Methyl- oder Methoxy-Gruppe an C-2 in das 1,4-Naphthochinongrundgerüst erhöhte leicht die antileishmanielle Aktivität, während die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe in dieser Position die Wirksamkeit drastisch reduzierte. Im Gegensatz dazu verstärkte offensichtlich eine Hydroxylierung an C-5 oder auch die Anwesenheit einer Dihydroxygruppierung an C-5 und C-8 die antileishmanielle Aktivität, während die Anwesenheit von Hydroxylgruppen in der Chinonteilstruktur die antiparasitäre Wirksamkeit drastisch verringerte. Die Anwesenheit einer freien Hydroxylgruppe in der Seitenkette peri zur Carbonyl Funktion, wie in der Reihe der Shikonin / Alkannin Derivate vorzufinden, erhöhte die Aktivität im Vergleich zu substituierten Strukturanaloga. Da die getesteten Furanonaphthoquinone sich als aktiver erwiesen als die entsprechenden Naphthochinone, erscheint es nahe liegend, dass die Anwesenheit eines Furanringes die antileishmanielle Aktivität von Naphthochinonen erhöht. Innerhalb der Reihe der untersuchten Verbindungen zeigte die Mischung der dimeren Vaforhizin und Isovaforhizin die höchste Aktivität in vitro gegen intrazelluläre Amastigoten mit einem IC50 von 1,1 μM. Die Shikonin / Alkannin Derivate erwiesen sich als ähnlich stark leishmanizid mit IC50- Werten im Bereich von 1 bis 3 μM. Keine der getesteten Naphthochinone war fähig, eine NOProduktion zu induzieren, welche eine entscheidende Rolle bei der Abwehr der Wirtszellen gegen intrazelluläre Pathogene spielt. Dies schließt eine Aktivierung von mikrobiziden Abwehrmechanismen in Makrophagen aus. Die Wirkungsweise hing offenbar von der Art und Position der Substituenten ab, verbunden mit den elektrophilen Eigenschaften des Naphthochinons oder das Ausmaß für einen Redoxzyklus. Auffällig war, dass die Vertreter mit einem oxygenierten Chinonring leishmanizide Aktivitäten zeigten, wenn sie mit Glutathion koinkubiert wurden, während der Großteil der übrigen Verbindungen inaktive Glutathion-Naphthochinon-Konjugate bildete.
