Fluorescence microscopes are limited by the diffraction barrier of light. This limit is ultimately defined by the wave-nature of light itself. Approximately 200 nm is the resolution limit for fluorescence microscopes using visible light. In this thesis 3D SD-dSTORM (3D spectral demixing direct stochastic optical reconstruction microscopy) is described, which is capable of resolving structures with sizes below the diffraction barrier. While dSTORM is already a widely used technique, spectral demixing is a novel approach to multicolor super-resolution and its development represents a major part of this thesis. When splitting the emission of a single molecule signal spectrally, a pair of localizations will be detected. Using two different fluorophores, the ratio of the detected intensities of each localization pair should be different and allows a distinction between the two fluorophores. By this, multicolor super- resolution without registration errors or aberration is achieved. How the physical hardware for this work was set up is described in detail and the software needed to acquire and analyze the data is discussed. A conceptual introduction to spectral demixing is given and the capabilities and functionality of the developed software to analyze the data is shown. Multicolor imaging is not the only benefit of spectral demixing, but also its noise-reducing potential is demonstrated. Furthermore, the registration error- free reconstruction and low crosstalk of multicolor data is presented. Those three features are rarely found in other super-resolution approaches. Spectral demixing is compatible with existing solutions to super-resolve structures in three dimensions. In this thesis, the approach to 3D by astigmatism with spectral demixing is demonstrated and the required temperature stabilization of the setup is discussed. The capability of 3D SD-dSTORM is demonstrated on examples from membrane biochemistry. Cluster sizes below the diffraction barrier of STOML3 in sensory neurons could be measured, the spatial correlation of GIT1 and bassoon at the neuronal active zone could be depicted as well as SNX9 rich tubular structures attached to clathrin coated pits in dynamin2 depleted cells. The versatility of the setup was demonstrated by using it as a single molecule total internal reflection microscope investigating the oligomerization-state of GPCRs on the plasma membrane. Finally the 3D SD-dSTORM is compared and positioned in relation to the multitude of current super-resolution techniques, acknowledging its novelty and advantages but not concealing the specific drawbacks, which every super- resolution approach possesses. An extensive discussion of improvements is given, as well as a comprehensive review of potential biological targets.
Fluoreszenzmikroskope unterliegen der Auflösungsgrenze, die durch die Wellennatur des Lichts vorgegeben ist. Für sichtbares Licht liegt damit die kleinste, noch abbildbare Strukturgröße bei 200 nm. In dieser Arbeit wird 3D SD-dSTORM (3D spectral demixing direct stochastic optical reconstruction microscopy) beschrieben, das die Abbildung von Strukturen unterhalb der Auflösungsgrenze möglich macht. Während dSTORM bereits ein weit verbreiteter Ansatz ist, stellt die spektrale Entmischung ein neuer Ansatz dar, um mehrfarben Hochauflösungsmikroskopie zu realisieren. Die Entwicklung der spektralen Entmischung ist ein wesentlichen Teil dieser Arbeit. Wenn die Lichtemission von einem Einzelmolekülsignal spektral aufgespalten wird, kann man ein Lokalisationspaar detektieren. Benutzt man zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe, kann aus dem Verhältnis der Intensitäten eines solchen Lokalisationspaares eine Unterscheidung zwischen den benutzten Farbstoffen getroffen werden. Dadurch ist die Hochauflösungsrekonstruktion frei von Registrierungs- und Aberrationsfehlern. Der physikalische Aufbau wird detailliert diskutiert und die Aufnahme- und Analysesoftware besprochen. Es gibt eine konzeptionelle Einführung in die spektrale Entmischung und eine komplette Betrachtung der Fähigkeiten und Funktionalität der entwickelten Software. Mehrfarben Mikroskopie ist nicht der einzige Vorteil der spektralen Entmischung, auch das Rauschreduktionspotential wird demonstriert. Des Weiteren kann die registrierungsfehlerfreie Rekonstruktion und das geringe Farbübersprechen demonstriert werden. Diese drei Funktionen sind kaum in anderen, aktuellen Techniken zu finden. Die spektrale Entmischung ist kompatibel mit bereits existierenden Ansätzen zur hochaufgelösten Darstellung von Strukturen in 3D. In dieser Arbeit wird der Ansatz “3D durch Astigmatismus” zusammen mit der spektralen Entmischung demonstriert und die hierfür erforderliche Temperaturstabilisierung diskutiert. Die Leistungsfähigkeit von 3D SD-dSTORM wird anhand von Anwendungsbeispielen aus der Membranbiochemie verdeutlicht. Clustergrößen von STOML3 in afferenten Neuronen konnten gemessen werden. Der räumliche Bezug zwischen GIT1 und Bassoon in der neuronalen, aktiven Zone konnte abgebildet werden sowie SNX9-reiche, tubuläre Strukturen an CCP in Dynamin2-verarmten Zellen. Die Einsatzflexibilität wurde durch die Verwendung als smTIRFM (single molecule total internal reflection microscope) demonstriert, wobei der Oligomerisationszustand von GPCRs untersucht wurde. Schließlich wird 3D SD- dSTORM mit einer Vielzahl von aktuellen Hochauflösungstechniken verglichen und eingeordnet, ohne die spezifischen Nachteile zu verschweigen, die für jede Hochauflösungstechnik immanent sind. Eine umfassende Diskussion der Verbesserungsmöglichkeiten, sowie eine weitgefasste Betrachtung von möglichen, biologischen Untersuchungsobjekten wird gegeben.
