Chorea Huntington (HD) ist eine progressiv verlaufende, autosomal dominant vererbte neurodegenerative Krankheit. Sie wird durch eine überlange Polyglutamindomäne im N-Terminus des Huntingtin- Proteins verursacht. Sowohl der Krankheitsmechanismus als auch die Funktion von Huntingtin sind bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wurde gezeigt, dass Huntingtin Exon 1 Proteine mit pathologischen Polyglutamindomänen (>37 Glutaminen) in vitro unlösliche Proteinaggregate mit fibrillärer Struktur bilden. Außerdem wurden Einschlusskörper mit aggregiertem Huntingtin-Protein in Gehirnen von transgenen Mäusen und von HD Patienten nachgewiesen. Dies führte zur Hypothese, dass die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten bei der Entstehung der Krankheit eine wichtige Rolle spielen könnte. In dieser Arbeit wurde die Coaggregation von Huntingtin Exon 1 Proteinen mit anderen polyglutaminhaltigen Proteinen im Detail untersucht. Mittels Affinitätschromatographie wurden mit myc- bzw. FLAG-Sequenzen markierte GST- Huntingtin Exon 1-Fusionsproteine mit Polyglutamindomänen im normalen (20-32 Glutaminen) und pathologischen Bereich (37-54 Glutaminen) gereinigt. Diese Proteine können auf Grund der Epitopmarkierung mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Nach der proteolytischen Abspaltung des GST-Anteils bildeten die freigesetzten Huntingtin Exon 1-Proteine mit überlangen Polyglutamindomänen unlösliche Proteinaggregate, während die Proteine mit einer Polyglutamindomäne im normalen Bereich nicht aggregierten. Huntingtin- Aggregate wurden durch einen keimabhängigen Prozess gebildet und haben eine fibrilläre Struktur. Die Fibrillogenese folgt dabei einer Kinetik erster Ordnung. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass immunogold markierte Huntingtin Exon 1-Proteine mit unterschiedlich langen Polyglutaminsequenzen in vitro koaggregieren. In Gegensatz dazu bildeten die polyglutaminhaltigen Proteine TBP (TATA-binding protein) und NOCT3 (nerval octamer binding factor 3) mit den Huntingtin-Proteinen keine SDS-resistenten Coaggregate. Das deutet darauf hin, dass die Bildung von polyglutaminhaltigen Proteinaggregaten ein hoch spezifischer Prozess ist. Die Ergebnisse in vitro wurden mit HD Zellkulturmodellsystemen bestätigt. In Säugetierzellen wurde eine Colokalisation von Huntingtin mit den Proteinen TBP, NOCT3 und PQBP1 (polyglutamine binding protein 1) nachgewiesen. Diese Proteine bildeten mit Huntingtin jedoch keine SDS-stabilen Coaggregate. Eine Colokalisation von mutiertem Huntingtin und den Proteinen NOCT3 und PQBP1 wurde auch in den Nervenzellen von HD transgenen Mäusen detektiert, was darauf hindeutet, dass eine Rekrutierung von Proteinen in polyglutaminhaltige Proteinaggregate eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit spielt.
Huntington?s disease (HD) is a progressive inherited neurodegenerative disorder caused by an elongated polyglutamine (polyQ) repeat located at the N-terminus of the huntingtin protein. The pathomechanism of HD as well as the normal function of huntingtin are unknown. Huntingtin exon 1 proteins with a polyQ stretch in the pathological range (>37 glutamines) form protein aggregates in vitro. Accumulated insoluble polyQ-containing protein aggregates have been found in intra- and perinuclear inclusions of HD transgenic mice and HD patients, suggesting that this disease is caused by high molecular weight protein aggregates. In this work it is examined whether N-terminal huntingtin exon 1 proteins co-aggregate with other polyQ-containing proteins. Using affinity chromatography, myc- and FLAG-tagged GST-huntintin exon 1 fusion proteins with polyQ sequences in the normal (20-32 glutamines) and pathological (37-54 glutamines) range were purified. These proteins can be detected with specific antibodies directed against the respective epitope tags. Proteolysis of GST-HD exon 1 fusion proteins with polyQ stretches in the pathological range, but not with polyQ stretches in the normal range resulted in the formation of SDS-insoluble protein aggregates. These aggregates assembled in a nucleation-dependent process and fibrillogenesis followed a first order kinetic. The structures formed exhibited a characteristic fibrillar morphology. Analysis by electron microscopy with immunogold labeling revealed that huntingtin exon 1 proteins with polyQ sequences in the pathological range coaggregate with huntingtin exon 1 proteins containing polyQ repeats in the normal range and form fibrillar structures. In strong contrast, polyQ-containing proteins such as the TATA binding protein (TBP) or the nerval octamer binding factor (NOCT3) did not form fibrils with mutant huntingtin exon1 proteins. This indicates that the assembly of fibrillar polyQ-containing structures is a highly specific process. The results obtained in vitro were confirmed using cell culture model systems of HD. In mammalian cells co-localization of huntingtin exon 1 proteins with TBP, NOCT3 and the polyQ-binding protein 1 (PQBP1) was observed. However, these proteins did not co-aggregate with huntingtin into SDS-stable fibrillar structures. Co- localization of mutant huntingtin exon 1 proteins with NOCT3 and PQBP1 was also observed in neuronal cells of HD transgenic mice, suggesting that depletion of soluble proteins by polyQ-containing protein aggregates may contribute to the pathogenesis in HD.
