High Throughput Protein Purification from Escherichia Coli for Functional Proteomics

Abstract

The completion of the sequencing of the human genome and the development of global high throughput approaches have changed and enriched biological experimentation. The most important task is nor the elucidation of the function of all encoded proteins. One of the limitations that prevent the application of biochemical methods to high-throughput experimentation is the inability to express and purify large numbers of proteins in high-throughput format. To develop a high-throughput method to purify proteins from E. coli, a 96-well format compatible protein purification process was developed for His6-tagged proteins under denaturing conditions. Under non-denaturing conditions the choice of the purification tag can have a significant impact on the purification success of individual proteins. To develop a general method for the parallel purification of many proteins, four different purifications tags were evaluated using a test set of 32 sequence-verified human cDNAs of varying sizes and activities. The basic purification process was adapted to the four different chemistries and all 128 constructs were purified and characterized with respect to yield and purity. This analysis revealed that the GST-tag and the MBP-tag were equally effective and purified 28/32 proteins. The purification methods were shown to be compatible with the functional integrity of the proteins. In order to evaluate the developed methods on a larger test set, 771 and 428 different proteins were purified with the His6-tag under denaturing conditions and the GST-tag under non- denaturing conditions respectively. In this experiment 67% of all His6-tagged proteins were be purified under non-denaturing and 49% of the GST-tagged proteins were purified under non-denaturing conditions. The biochemical and biophysical parameters of the purified proteins were analyzed to identify protein properties that are predictive of protein purification success from bacteria. We found that the length of the single longest hydrophobic stretch in the primary structure of His6-tagged proteins determines the likelihood of successful protein purification.

Die vollstaendige Sequenzierung des menschlichen Genoms und die Entwicklung von globalen experimentellen Ansätzen haben die biologische Forschung verändert und bereichert. Die funktionelle Charakterisierung aller Proteine ist zur Zeit eine der dringensten Aufgaben. Leider sind biochemischer Methoden für funktionelle Studien im Verfahren mit hohem Durchsatz zur Zeit nicht nutzbar, da die hierzu erforderlichen Proteine nicht im Horchdurchsatzverfahren aufgereinigt werden koennen. Um eine allgemein anwendbare Methode fuer die parallele Aufreinigung von vielen verschiedenen Proteinen unter nicht-denaturierenden Bedingungen zu entwickeln, wurde zunächst ein Reaktionsplatten-kompatibler Prozess fuer Proteinaufreinigungen von Bakterien erarbeitet und anschliessend wurden vier verschiedene Affinitätsankerproteine im Kontext von 32 Test-Proteinen evaluiert. Alle 128 Fusionsproteine wurden im Reaktionsplattenformat aufgereinigt und in Bezug auf Reinheit und Ausbeute charakterisiert. Diese Analyse ergab, das der Glutathione-S-Transferase-Anker ("GST-tag") und der Maltose-Bindungs-Protein- Anker ("MBP-tag") gleich effektiv waren und die Aufreinigung von 28/32 beziehungsweise 28/31 Proteinen ermoeglichten. Es wurde gezeigt, dass beide Aufreinigugsmethoden funktionelle Proteine produzierten. Um die entwickelten Methoden mittels eines größeren Proteinsatzes zu evaluieren, wurden 771 beziehungsweise 428 verschiedene Proteine als His6-Fusionsproteine beziehungsweise als GST-Fusionsproteine aufgereinigt. In diesem Experiment konnten 67% aller His6-Fusionsproteine unter denaturierenden Bedingungen und 49% aller GST-Fusionsproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden. Letztlich wurden biochemische und biophysikalische Daten aller Proteine untersucht um Eigenschaften zu identifizieren, die es ermöglichen den Aufreinigungserfolg einzelner Proteine vorherzusagen. Unter anderem wurde festgestellt, dass die Länge, des längsten durchgehenden Abschnittes der Primärstruktur mit einer durchschnittlichen Hydrophobizität >0.85 (nach Goldman, Engelman, Steiz) mit dem Aufreinigungserfolg von His6-Fusionsproteinen korreliert.