Wie frühere Studien zeigten, hebt sich der Wachstums- und Differenzierungsfaktor GDF-3 (growth and differentiation factor 3) v
Wie frühere Studien zeigten, hebt sich der Wachstums- und Differenzierungsfaktor GDF-3 (growth and differentiation factor 3) von den übrigen Mitgliedern der TGF-Superfamilie durch sein einzigartiges Expressionsmuster ab: Die GDF-3 Expression in adulten Mäusen ist mit Ausnahme des Fettgewebes auf lymphatische Gewebe beschränkt. Über die Funktion des Proteins war dennoch nichts bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von GDF-3 in lymphatischen Geweben zu untersuchen.
Eine Kombination aus MACS Technologie (magnetic cell sorting) und quantitativer LightCycler PCR ermöglichte es, die GDF-3 exprimierenden Zellen aus einer Vielzahl von Zellpopulationen zu ermitteln und anhand ihrer Oberflächenmarker zu charakterisieren. Es handelt sich um adhärent wachsende, B220/Thy1.2/CD11b/CD11c/CD45 negative Zellen, d.h. Nicht-Leukozyten. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung, bei der antisense RNA als Sonde für GDF-3 verwendet wurde, konnten die GDF-3 exprimierenden Zellen in Gefrierschnitten der Milz eindeutig als Stromazellen der roten Milzpulpa identifiziert werden.
In einer Reihe von in vitro Stimulationsexperimenten zeigte LPS (Lipopolysaccharid) eine deutlich negative Wirkung auf die GDF-3 Expression in Milzzellen. Es kann sich dabei um einen direkten oder indirekten regulatorischen Effekt handeln.
Durch gezielte Depletion spezifischer Zellpopulationen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass zur konstitutiven Expression von GDF-3 die Anwesenheit von CD11b, CD11c und DX5 positiven Zellen unbedingt erforderlich ist, während B und T Lymphozyten keine Rolle spielen. CD11b positive Zellen konnten immunohistochemisch in Gefrierschnitten der Milz nachgewiesen werden. Ihre Ko- Lokalisation mit den GDF-3 exprimierenden Stromazellen spricht dafür, dass CD11b positive Zellen die Regulation der GDF-3 Expression unmittelbar beeinflussen. Vermutlich wird die GDF-3 Expression durch den direkten Zellkontakt mit CD11b positiven Zellen aufrechterhalten. Denn der negative Effekt der CD11b Depletion lässt mit der Zugabe von Kulturüberstand von Gesamtmilz nicht kompensieren. Lediglich durch die Wiederzuführung der CD11b positiven Zellen, nicht aber durch den Gesamtmilz-Überstand ließ sich die GDF-3 Expression wiederherstellen. Daher handelt es sich offenbar nicht um sezernierte Faktoren, welche für die konstitutive GDF-3 Expression verantwortlich sind.
Die Experimente bekräftigen die Hypothese, nach der GDF-3 einen Teil des Ensembles von Wachstums- und Differenzierungsproteinen darstellt, welches die Prozesse der Immunabwehr steuert.
The growth and differentiation factor 3 (GDF-3) is unique among the members of the TGF-super family
The growth and differentiation factor 3 (GDF-3) is unique among the members of the TGF- super family. It is almost exclusively expressed in lymphoid tissues (Mc Pherron and Lee, 1993), suggesting a role for GDF-3 in the maintenance and/or regulation in the immune system.
Combining MACS technology, quantitative RT-PCR, and in situ hybridisation, the cellular source of GDF-3 secretion within primary and secondary lymphoid tissues could be identified. Magnetic cell sorting (MACS) was applied to separate distinct cell populations according to their specific surface markers to a high purity. mRNA was isolated from the different cell types, reversely transcribed into cDNA, and analysed by quantitative, sequence-specific PCR utilising the LightCycler system. mRNA from total lymphoid tissues was isolated for comparison. Prior to quantification, all samples were normalised to expression of the housekeeping gene ?-Actin. GDF-3 transcript could specifically be detected in B220/Thy1.2/CD11b/CD11c/CD45 negative, adherently growing cells. In situ hybridisation of spleen sections revealed the morphological pattern of the GDF-3 expressing cells. They were clearly identified as stromal cells of the red pulp.
To address the question whether GDF-3 expression is regulated, a series of in vitro experiments was performed. Stimulation of splenocytes with Lipopolysaccharide (LPS), a bacterial antigen that activates the immune response, leads to a dramatic downregulation of GDF-3 expression. Furthermore, CD11b+ cells, CD11c+ cells, and DX5+ cells were found to be required to maintain GDF-3 expression in culture. Immunohistochemistry showed that CD11b+ cells are co-localised with the GDF-3 expressing stromal cells in the red pulp of spleen, suggesting an immediate effect for CD11b+ cells in the regulation of GDF-3 expression. If added to CD11b-depleted splenocytes, the CD11b+ fraction, but not conditioned medium from total spleen can restore full GDF-3 expression. Therefore, GDF-3 expression is mediated by direct cell contact rather than by a secreted factor.
In conclusion, the data provides strong evidence that GDF-3 is part of the complex ensemble of secreted proteins that govern the immune function.
