In der vorliegenden Studie wurde die Mausmutante "short digits" (Dsh) analysiert. Bei "short digits" (Dsh) handelt es sich um eine strahleninduzierte Mausmutante mit autosomal semidominantem Erbgang, deren Phänotyp erstmalig 1993 von Selby et al. beschrieben wurde. Ziel der Arbeit war es, die Dsh Mausmutante weiterführend morphologisch und molekular zu charakterisieren und den für die Phänotypen zugrunde liegenden molekularen Defekt zu entschlüsseln. Homozygote Dsh/Dsh Mäuse sind charakterisiert durch eine Vielzahl von internen und skelettären Defekten und beinhalten schwere Mittelliniendefekte. Der Dsh/Dsh Phänotyp gleicht dem der Shh-/- Maus. Der gemeinsame Phänotyp ist durch den Holoprosencephalie Phänotyp charkterisert. Mit einem genetischen Komplementationstest konnte gezeigt werden, dass Dsh und Shh allelisch sind. Es konnte jedoch durch DNA Sequenzierung des 14 kb umfassenden Shh Locus sowie der Shh cDNA keine Mutation im Dsh Kandidatengen Shh nachgewiesen werden. Im Rahmen eines positionellen Klonierungsansatzes konnte gezeigt werden, dass Dsh durch eine große chromosomale Inversion verursacht wird: Die zunächst durchgeführte Feinkartierung konnte trotz 1000 analysierter Meiosen den Dsh Locus auf Chromosom 5 nicht wie erwartet einengen. Die beobachtete Unterdrückung der Rekombination bis in die Bruchpunktregion ist auf das chromosomale Rearrangement zurückzuführen. Die Inversionsbruchpunkte wurden durch einen klassischen Screen mit Hilfe von Southern Blot Hybridisierungen identifiziert, die Inversion durch FISH Analysen auf Chromosen bestätigt. Durch die Analyse der Bruchpunktregionen mit Hilfe der ermittelten Bruchpunktsequenzen kann gezeigt werden, dass kein Gen direkt von der Dsh Inversion, welche 11,7 Mb umfasst, betroffen ist. Quantitative Realtime PCR Experimente zeigen, dass die Expression der zum Teil sehr weit entfernten, flankierenden Gene beider Bruchpunkte durch die Dsh Inversion nicht beeinträchtigt sind und somit nicht in kausalem Zusammenhang mit den Mechanismen stehen, die zum Dsh/Dsh bzw. Dsh/+ Phänotyp führen. Die Dsh Inversion, deren telomerer Bruchpunkt sich 13 kb vom Shh Gen befindet, läßt die Exone, den Promoter und 2 Enhancer intakt. Die Inversion führt zu einem Positonseffekt, der die Regulation von Shh betrifft. Humane Translokationen, die sich 15-265 kb stromaufwärts des Shh Promoters befinden und zu Holoprosencephalie Phänotypen führen, weisen ebenso wie die Dsh Mausmutante auf das Vorhandensein von cis-regulatorischen Elementen hin. Diese Elemente werden vor allem bei Entwicklungsgenen, wie z.B. Shh, für die exakte zeitliche und räumliche Steuerung der Genexpression benötigt. Durch eine bioinformatische in silico Analyse konnte gezeigt werden, dass im 1Mb umfassenden Shh "gene desert" 5 putativ cis-regulatorische DNA Elemente vorhanden sind. Diese Ergebnisse stellen eine plausible Erkärung dafür dar, weshalb die Dsh Inversion zu einer Dysregulation der Shh Genexpression führt. Homozygote Dsh/Dsh Embryonen weisen in sehr frühen Entwicklungstadien kein Shh Transkript auf, was den schweren Mittelliniendefekt Phänotyp erklärt, der sich im selben Maß in Shh Embryonen manifestiert. In späteren Entwicklungstadien (E 13.5) erfolgt eine Reexpression, die mit Hilfe von in situ Hybridisierungen im Proboscis nachgewiesen werden konnte. In heterozygoten Dsh/+ Embryonen führt die Inversion zunächst zu einer erwarteten, ungefähr 50% Reduktion der Shh Transkriptmenge im Vergleich zum Wildtyp. Ab E 13.5 erfolgt im Gegensatz zum Wildtyp eine stark hochregulierte und ektope Shh Expression in der Extremitätenknospe. Dies hat die Aktivierung von Hedgehog Zielgenen, wie z.B Pthlh zur Folge. Der für eine Normalentwicklung von Fingern und Gelenken essentielle Ihh-Pthlh Regelkreislauf wird gestört, was eine verzögerte Chondrozytendifferenzierung nach sich zieht, in deren Folge sich der Dsh/+ Phänotyp ausbildet: Die kurzen Finger ("short digits") die durch eine Fusion der ersten und zweiten Phalanx im Finger 2- 5 und einer verkürzten proximalen Phalanx im Finger 1 hervorgerufen werden, sind namensgebend für die Dsh Mutante. Dieser heterozygote Phänotyp ist der humanen Brachydactyly Typ A1 sehr ähnlich, die durch Mutationen in IHH zu einer Verkürzung bzw. zum Verlust der mittleren Phalangen führt. Desweiteren konnten in Dsh/+ Mäusen strukturelle Veränderungen im Kleinhirn nachgewiesen werden, deren Zusammenhang mit der Shh Dysregulation noch untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der funktionellen Analyse der in silico identifizierten, putativ cis-regulatorischen DNA Elemente begonnen. Die generierten transgenen Reportermäuse und die Analyse der Embryonen aus deren Nachkommenschaft wurden in dieser Arbeit kurz dargestellt. Zusammengefasst zeigt die molekulargenetische Analyse der Dsh Mausmutante neue Einblicke in den komplexen Regulationsmechanismus von Shh und deren Beteiligung in den Prozessen von Entwicklung und Krankheit.
In this study the mouse mutant "short digits" (Dsh) was analysed. Dsh is a radiation induced mouse mutant with autosomal semidominant mode of inheritence. The Dsh phenotype was initially described in 1993 by Selby et al. Aim of the study was the morphological and molecular characterisation of the Dsh mutant and to unravel the genetic basis , which is causitive for the phenotypes. Homozygous Dsh/Dsh mice are characterised by a multitude of internal and skeletal defects, including severe midline defects. The Dsh/Dsh and Shh-/- phenotypes are very similar. The shared phenotype is characterized by holoprosencephaly. Using a genetic complementation test we were able to demonstrate that Dsh and Shh are allelic. However, sequencing of a genomic 14 kb Shh locus and Shh cDNA showed no mutation in the canditate gene Shh. Using a positional cloning approach we were able to demonstrate that Dsh is caused by a large chromosomal inversion: Despite analysing a thousand meioses in the initial fine mapping we could not substantially reduce the interval of the Dsh Locus on chromosome 5 as expected. The observed suppression of recombination in proximity of the breakpoints is due to the chromosomal rearrangement. Identification of the inversion breakpoints was done with a classic screen using southern blot hybridisations, the inversion was confirmed by FISH analyses on chromosomes. The sequence based analyses of the breakpoint region shows that no gene is affected through the Dsh inversion, which compromises 11,7 Mb. Using quantitative Realtime PCR we could show, that the expression of the flanking genes on both sides of the breakpoints are not affected by the Dsh inversion, and therefore can not be causative for the mechanisms which lead to the Dsh/Dsh or Dsh/+ phenotypes. The Dsh inversion, which telomer breakpoint is located 13 kb upstream of the Shh gene, leaves the exons, the promoter and two enhancers intact. The inversion leads to a position effect, which affects the regulation of the Shh gene. In humans, translocations 15 to 265 kb 5' of the Shh promoter lead to holoprosencephaly phenotypes; these findings and the Dsh mouse mutant point to the existance of cis-regulatory elements. These elements are needed especially for genes associated with development, like Shh, to ensure correct spatio-temporal gene expression. Using a bioinformatic in silico analysis, we were able to show that the 1 Mb Shh "gene desert" harbours 5 putative cis-regulatory DNA elements. This result is a good explanation for the observed dysregulation of Shh gene expression caused by the Dsh inversion. In early development homozygous Dsh/Dsh embryos are lacking Shh transcript, which explains the severe midline defect, which is manifesting to the same extent in Shh-/- embryos. In later stages of development ( E13.5) we were able to show reexpression of Shh in the proboscis using in situ hybridisation. In the hereozygote Dsh/+ embryos the inversion leads to an expected 50% reduction of Shh transcript in comparison to the wildtype. Beginning with E 13.5 Shh is strongly upregulated and ectopicially expressed in the limb compared to the wildtype, which leads to the activation of hedgehog target genes , like e.g. Pthlh. The Ihh-Pthlh feedback loop, which is essentiell for the development of digits and joints is disturbed, which results in a delayed chondrocyte differentation and the consequent development of the Dsh/+ phenotype: The short digits, hence the name of the mutant, are caused by a fusion of the first and second phalanx in digit 2-5 and a shortened proximal phalanx in digit 1. The described heterozygous phenotype is very similar to the human congenital disease brachydactyly type A1 , which is caused by mutations in IHH leading to shortening or loss of the middle phalanges. In addition we could show structural changes in the morphology of the cerebellum of Dsh/+ mice. In this study the functional analysis of the in silico identified putativ cis-regulatory DNA elements was initiated. The generated transgene reporter mice and the analysis of the resulting embryos were mentioned in brief. In summary the genetic and molecular analysis of the Dsh mouse mutant shows new insights in the complex regulation of Shh gene expression and the involvement in the processes of development and disease.
