Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are the most complex class of glycolipids present on the membrane of eukaryotic cells. GPIs share the common core structure: Manα(1→2)Manα(1→6)Manα(1→4)GlcNα(1→6)-myo-Inositol-1-PO4-lipid, which is generally modified in a tissue and cell-dependent manner by additional phosphorylations, carbohydrate side chains and the presence of additional fatty acid chains. GPIs can be found as free glycolipids or attached to the C-terminus of the proteins using a phosphoethanolamine unit on the Man-III residue of the glycan core forming the so-called GPI-anchored proteins (GPI-APs). These GPI-anchored proteins are known to play an important role in various biological processes and have gained the interest of synthetic chemists and biologists. In a recent report, our group has shown that the glycan part of a GPI of T. gondii can be used as a diagnostic marker for toxoplasmosis and to distinguish between latent and acute infection based on the detection of the anti-GPI IgG and IgM antibodies levels in patient sera using microarrays. In order to expand the diagnostic potential of the GPI of T. gondii for a sero-epidemiological study, in the first part of this work, the phosphoglycan part of GPIs from T. gondii was synthesized and used in the development of a diagnostic test for toxoplasmosis using a bead-based assay. It was demonstrated that the selected GPI glycan can be used to distinguish between infected and healthy cases using a Luminex-based sero-diagnostic assay. Different conditions were optimized, including: coupling of the antigen to the magnetic beads, antigen concentration, secondary antibody conjugation type and concentration, serum sample dilution and buffer composition. Under optimized conditions, 180 human serum samples were analyzed identifying the positive cases with 95 % specificity and 76 % sensitivity. Furthermore, these results were compared with the results from ELISA showing less than 10 % false negative rate. The high specificity and sensitivity along with less false negative results using GPI molecule indicated that GPI based Luminex assay can be used as a valuable tool for the diagnosis of toxoplasmosis in clinical settings. To obtain a better understanding of the GPI structures and biological functions of these glycolipids, in the second part of this work a paramagnetic NMR technique was employed along with the MD simulations to study the conformation and dynamics of the glycan part of the core of GPI anchors. In order to use paramagnetic ions (Lanthanides) assisted NMR spectroscopy, the disaccharides Manα1→2Man and Manα1→6Man, and the trisaccharide Manα1→2Manα1→6Man fragments of the GPI-core tagged with a metal chelating unit were successfully synthesized. First, a linker containing a tagging unit was synthesized from 1,2-diamino benzene in a four step process. Then, this linker was coupled to the GPI fragment having an amine at the reducing end. 1H and 1H-13C HSQC spectra of the synthesized tagged-GPI fragments were acquired in the presence of diamagnetic reference (La3+) and paramagnetic metal ions (Dy3+, Yb3+, Eu3+). To obtain structural information of the glycans, the pseudocontact shift (PCS) values were determined for each proton and carbon as the difference of 1H and 13C chemical shift values between the carbohydrate complex with paramagnetic metal ion and diamagnetic reference in all the three fragments. The PCS values obtained experimentally were compared with the data obtained from the computational analysis. The experimental PCS values showed a good agreement with the back calculated PCS (Q) values. In the case of Manα1→2Man disaccharide, the better agreement was obtained when europium (Eu3+) and ytterbium (Yb3+) were used. Europium as paramagnetic ion showed a narrow distribution around 0.05, ytterbium (Yb) produced the lowest Q-values on the selected single frames even lower than 0.01 suggesting that both metal ions are equally good. The characteristic molecular geometries of the disaccharide Manα1→2Man and Manα1→6Man resulted from the NMR experiments and molecular dynamics study showed that in case of . disaccharide Manα1→2Man, the non-reducing mannose Man2 is always in close proximity to the metal ion, indicating the most probable conformation as shown in the Figure 1a. In case of Manα1→6Man, the most visited conformation was the extended conformation showed in Figure 1b. These results confirmed previous observations assigning the flexibility of the GPI core to the α1→6 linkage, which has an additional rotation around the glycosidic linkage. Furthermore, this study demonstrated the high flexibility of the glycans and the need of using a larger and rigid linker in paramagnetic NMR experiments. The third part of this work focused on the synthesis of GPI building blocks for the semi-synthesis of GPI-anchored proteins from protozoan and mammalian cells. For this process, the synthetic GPIs were obtained containing a cysteine residue attached to the phosphoethanolamine unit. The cysteine can undergo a chemoselective reaction with a C terminal protein thioester via a trans-thioesterification and rearrangement processes to give GPI anchored proteins. The synthesis of the GPIs 76 and 77 were completed following a convergent synthetic strategy. These two GPIs are currently being used for the development of semi-synthetic methods to obtain homogeneous GPI-anchored proteins to reveal the significance of glypiation in the structure and activity of these proteins.
Glykosylphosphatidylinositole (GPIs) bilden die komplexeste Klasse der auf eukaryotischen Zellmembranen vorkommenden Glykolipide. GPIs haben folgende gemeinsame Kernstruktur: Manα(1→2)Manα(1→6)Manα(1→4)GlcNα(1→6)-myo- Inositol-1-PO4-Lipid, die im Allgemeinen auf gewebe- und zellspezifische Art durch zusätzliche Phosphorylierungen, Kohlenhydratseitenketten und das Vorkommen weiterer Fettsäureketten modifiziert ist. GPIs können als freie Glykolipide vorkommen, oder sind mit Hilfe einer Phosphoethanolamin-Einheit am Man-III-Rest des Glykankerns am C-Terminus von Proteinen verankert. Die so gebildeten Moleküle werden GPI-verankerte Proteine (GPI-AP) genannt. Diese GPI-verankerten Proteine spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen biologischen Prozessen und haben das Interesse vieler synthetischer Chemiker und Biologen geweckt. In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte unsere Gruppe zeigen, dass der Kohlenhydratanteil des GPIs von T. gondii als diagnostischer Marker für Toxoplasmose eingesetzt werden kann, und sogar eine Unterscheidung zwischen einer latenten und einer akuten Infektion auf der Basis der Detektion von anti-GPI IgG und IgM Antikörper-Titern in den Seren von Patienten mittels Mikroarray-Technologie möglich ist. Um das diagnostische Potential des GPIs von T. gondii für eine sero-epidemiologische Studie zu erweitern, wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Phosphoglykan-Anteil des GPIs von T. gondii als Marker synthetisiert und für die Entwicklung eines diagnostischen Tests für Toxoplasmose in einem Bead-basierten Testverfahren angewendet. Es wurde gezeigt, dass das ausgewählte GPI-Glykan eingesetzt werden kann, um zwischen infizierten und gesunden Personen mittels eines Luminex-basierten sero-diagnostischen Verfahrens zu unterscheiden. Verschiedene Bedingungen wurden optimiert, darunter Antigen-Konzentration, Konjugationstyp des sekundären Antikörpers sowie dessen Konzentration, Verdünnung der Serum-Probe, und die Pufferzusammensetzung. Unter den optimierten Bedingungen wurden dann 180 humane Serum-Proben analysiert, wobei die positiven Proben mit 95 % Spezifizität und 76 % Sensitivität identifiziert werden konnten. Weiterhin wurden diese Ergebnisse mit denen aus einem ELISA- Test verglichen, was eine Rate von falsch-negativen Ergebnissen von unter 10 % zeigte. Die hohe Spezifizität zusammen mit wenigen falsch-negativen Ergebnissen bei Anwendung des GPI-Moleküls zeigen, dass dieses GPI-basierte Luminex-Verfahren als wertvolles Werkzeug für die Diagnose von Toxoplasmose im klinischen Umfeld eingesetzt werden kann. Um ein besseres Verständnis der GPI- Strukturen und der biologischen Funktionen dieser Glykolipide zu erlangen, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine paramagnetische NMR-Methode zusammen mit MD (Molekulardynamik)-Simulationen angewendet, um die Konformation und Dynamiken des Glykananteils des GPI-Kerns zu untersuchen. Um paramagnetische- Ionen (Lanthanoide)-unterstützte NMR-Spektroskopie nutzen zu können, wurden die Disaccharidfragmente Manα1→2Man und Manα1→6Man, sowie das Trisaccharidfragment Manα1→2Manα1→6Man des GPI-Kerns mit einer chelatbildenden Verbindung erfolgreich synthetisiert. Zuerst wurde ausgehend von 1,2-diamino- Benzen ein Linker mit einer Tag-Einheit in vier Schritten synthetisiert. Daraufhin wurde dieser Linker an das GPI-Fragment, welches ein Amin am reduzierenden Ende trägt, angehängt. 1H und 1H-13C HSQC Spektren der synthetisierten getaggten GPI-Fragmente wurden in Gegenwart des diamagnetischen Referenz-Ions (La3+), sowie in Gegenwart der paramagnetischen Metallionen (Dy3+, Yb3+, Eu3+) aufgenommen und analysiert. Um strukturelle Informationen über die Glykane zu erlangen, wurden die PCS-Werte (Pseudo- Kontakt-Verschiebung) als die Differenz der chemischen Verschiebungen von 1H und 13C zwischen dem Kohlenhydratkomplex mit paramagnetischem Ion und der diamagnetischen Referenz in allen drei Fragmenten für jedes Proton und jedes Kohlenstoffatom berechnet. Die experimentell erhaltenen PCS-Werte wurden schließlich mit den Daten aus der rechnergestützten Analyse verglichen. Die experimentellen PCS-Werte zeigen eine gute Übereinstimmung mit den zurückgerechneten PCS (Q)-Werten. Im Falle des Disaccharid-Fragmentes Manα1→2Man wurde die höchste Übereinstimmung erreicht, wenn Europium (Eu3+) und Ytterbium (Yb3+) genutzt wurden. Europium als paramagnetisches Ion zeigte eine enge Verteilung um 0.05, Ytterbium generierte die niedrigsten Q-Werte für die ausgewählten Einzelbilder, sogar unter 0.01, was darauf hinweist, dass beide Metallionen gleichwertig einsetzbar sind. Die charaktieristischen molekularen Geometrien der Disaccharid-Fragmente Manα1→2Man und Manα1→6Man ergaben sich aus den NMR-Experimenten und die Molekulardynamik-Modellierung zeigte, dass im Falle des Disaccharids Manα1→2Man die nichtreduzierende Mannose Man2 stets in direkter Nachbarschaft zu dem Metallion ist, was die in Abbildung 1a gezeigte Konformation als die wahrscheinlichste Konformation nahelegt. Im Falle von Manα1→6Man ist die häufigste Konformation die gestreckte Konformation, die in Abbildung 1b dargestellt ist. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Beobachtungen, welche die Flexibilität des GPI-Kerns der α1→6-Bindung zuordneten, die eine zusätzliche Rotation um die glykosidische Bindung hat. Außerdem demonstriert diese Studie die hohe Flexibilität der Glykane und den Bedarf eines größeren und starreren Linkers in paramagnetischen NMR-Experimenten. Der dritte Teil dieser Arbeit behandelt schwerpunktmäßig die Synthese von GPI-Bausteinen für die Semi-Synthese von GPI-verankerten Proteinen von Protozoen sowie Säugerzellen. Dafür wurden die synthetischen GPIs mit einem Cystein-Rest an der Phosphoethanolamin-Einheit generiert. Dieser Cystein-Rest kann eine chemoselektive Reaktion mit einem C-terminalen Protein-Thioester über eine Trans-Thioesterifizierung und Umlagerungsreaktionen eingehen, um schließlich GPI-verankerte Proteine zu ergeben. Die Synthese der GPIs 76 und 77 wurde entsprechend einer konvergenten Synthese-Strategie abgeschlossen. Diese beiden Modell-GPIs werden zurzeit für die Entwicklung semisynthetischer Methoden für die Herstellung homogener GPI- verankerter Proteine genutzt, um den Stellenwert der GPI-Verankerung in der Struktur und Aktivität dieser Proteine deutlich zu machen.
