dc.contributor.author
Garg, Monika
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:48:52Z
dc.date.available
2018-04-04T09:15:22.844Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5441
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9640
dc.description
Table of Contents Table of contents.………………………………………………...……………..…………………..……….1
List of Abbreviations 5 Summary 9 Zusammenfassung 13 Chapter 1 19 Introduction
19 1.1 General Introduction to the Glycome 19 1.2 Introduction to the
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor 22 1.3 Biosynthesis of GPI-Anchors
and their attachment to proteins 23 1.3.1 Biosynthetic assembly of the GPI
glycan core 24 1.3.2 Attachment of GPIs to Proteins 25 1.3.3 Remodeling of
GPIs after the attachment to proteins 25 1.4 Diversity in GPI anchor
structures 26 1.5 Importance of the GPI anchor and GPI-anchored proteins 27
1.5.1 Functions of GPI-anchored proteins 27 1.5.2 Functions of the GPI anchor
27 1.5.3 GPI anchor structure-mediated properties of the GPI-anchored proteins
28 1.6 Chemical Synthesis of the GPI anchor 29 1.6.1 Total synthesis of GPIs
30 1.6.2 Synthesis of GPIs using a Linear Strategy 31 1.6.3 Synthesis of GPIs
using a Convergent Strategy 32 1.7 GPI anchor mediated immunological response
33 1.8 Analysis of the Conformation and Dynamics of Carbohydrates 37 1.8.1
Conformation of Monosaccharides (Only Pyranose ring) 37 1.8.2 Conformation of
Disaccharide or oligosaccharides 38 1.8.3 Conformational analysis of GPIs 40
1.9 Aim of the thesis 42 Chapter 2 45 Synthetic GPIs for the Diagnosis of
Toxoplasmosis Using Multiplex Bead Assay 45 2.1 Introduction 45 2.2 Multiplex
bead assay (Luminex Technology) 47 2.3 Synthesis of GPI 1 of Toxoplasma gondii
49 2.4 Luminex-based Multiplex Assay Optimization 55 2.4.1 Optimization of the
Antigen (GPI 1) concentration and of the secondary antibody 55 2.4.2
Optimization of the secondary antibody concentration 58 2.4.3 Serum sample
dilution 58 2.5 Conclusion and Perspective 64 Chapter 3 65 Synthesis of
paramagnetic chelating GPI’s fragments to study the conformation and dynamics
using Paramagnetic NMR spectroscopy 65 3.1 Introduction 65 3.2 Paramagnetic
effect – source of long distance information 67 3.3 Synthesis of paramagnetic
chelating fragments of GPI anchor 69 3.3.1 Synthesis of paramagnetic chelating
unit 71 3.3.2 Synthesis of the tagged Manα1→6Man disaccharide fragment 71
3.3.3 Synthesis of the tagged Manα1→2Man disaccharide fragment 74 3.3.4
Synthesis of the tagged Manα1→2Man α1→6Man trisaccharide fragment 76 3.3.5
Molecular Dynamics Study 84 3.4 Conclusion 89 Chapter 4 91 Synthesis of GPIs
for the Semi-synthesis of GPI-anchored proteins 91 4.1 Introduction to the
GPI-anchored protein 91 4.2 Retrosynthesis of a Cysteine-containing GPI-anchor
92 4.3 Assembly of glycan core of GPI-anchor 95 4.4 Synthesis of protozoan GPI
anchor containing a Cysteine residue 96 4.5 Synthesis of a mammalian GPI
anchor containing a Cysteine residue 98 4.6 Conclusion and perspective 99
Chapter 5 101 Experimental Section 101 5.1 General Materials and Methods 101
5.2 Experiment to Chapter 2 102 5.2.1 Synthesis of the GPI 1 from T. gondii.
102 5.2.2 Synthesis of the cross-linker for the modification of MagPlex beads
112 5.2.3 Experiments for the Luminex-based Assay 113 5.3 Experiment to
Chapter 3 117 5.3.1 Synthesis of protected Chelating Linker: 117 5.3.2
Synthesis of tagged Disaccharide (Manα1→6Man): 118 5.3.3 Synthesis of tagged
Disaccharide (Manα1→2Man): 129 5.3.4 Synthesis of tagged Trisaccharide
(Manα1→2 Manα1→6Man): 133 5.4 Experiment to Chapter 4 147 5.4.1 Synthesis of
Man-I 147 5.4.2 Synthesis of bilipidated biphosphorylated GPI 148 5.4.3
Synthesis of monolipidated triphosphorylated GPI 159 Appendix 1 163 A.
Synthesis of Glycan for affinity Chromatography 163 A.1 Synthesis of a
Trimannoside (Manα1-2-Manα1-6-Man) for the affinity purification of proteins
164 A.2 Experimental Section 166 B. Synthesis of N,N’ diacetyllactosamine
(LacDiNAc) for the analysis of N-glycome of Nematodes 173 B.1 Synthesis of
LacDiNAc 173 B.2 Experimental Section 175 References 184
dc.description.abstract
Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are the most complex class of glycolipids
present on the membrane of eukaryotic cells. GPIs share the common core
structure: Manα(1→2)Manα(1→6)Manα(1→4)GlcNα(1→6)-myo-Inositol-1-PO4-lipid,
which is generally modified in a tissue and cell-dependent manner by
additional phosphorylations, carbohydrate side chains and the presence of
additional fatty acid chains. GPIs can be found as free glycolipids or
attached to the C-terminus of the proteins using a phosphoethanolamine unit on
the Man-III residue of the glycan core forming the so-called GPI-anchored
proteins (GPI-APs). These GPI-anchored proteins are known to play an important
role in various biological processes and have gained the interest of synthetic
chemists and biologists. In a recent report, our group has shown that the
glycan part of a GPI of T. gondii can be used as a diagnostic marker for
toxoplasmosis and to distinguish between latent and acute infection based on
the detection of the anti-GPI IgG and IgM antibodies levels in patient sera
using microarrays. In order to expand the diagnostic potential of the GPI of
T. gondii for a sero-epidemiological study, in the first part of this work,
the phosphoglycan part of GPIs from T. gondii was synthesized and used in the
development of a diagnostic test for toxoplasmosis using a bead-based assay.
It was demonstrated that the selected GPI glycan can be used to distinguish
between infected and healthy cases using a Luminex-based sero-diagnostic
assay. Different conditions were optimized, including: coupling of the antigen
to the magnetic beads, antigen concentration, secondary antibody conjugation
type and concentration, serum sample dilution and buffer composition. Under
optimized conditions, 180 human serum samples were analyzed identifying the
positive cases with 95 % specificity and 76 % sensitivity. Furthermore, these
results were compared with the results from ELISA showing less than 10 % false
negative rate. The high specificity and sensitivity along with less false
negative results using GPI molecule indicated that GPI based Luminex assay can
be used as a valuable tool for the diagnosis of toxoplasmosis in clinical
settings. To obtain a better understanding of the GPI structures and
biological functions of these glycolipids, in the second part of this work a
paramagnetic NMR technique was employed along with the MD simulations to study
the conformation and dynamics of the glycan part of the core of GPI anchors.
In order to use paramagnetic ions (Lanthanides) assisted NMR spectroscopy, the
disaccharides Manα1→2Man and Manα1→6Man, and the trisaccharide
Manα1→2Manα1→6Man fragments of the GPI-core tagged with a metal chelating unit
were successfully synthesized. First, a linker containing a tagging unit was
synthesized from 1,2-diamino benzene in a four step process. Then, this linker
was coupled to the GPI fragment having an amine at the reducing end. 1H and
1H-13C HSQC spectra of the synthesized tagged-GPI fragments were acquired in
the presence of diamagnetic reference (La3+) and paramagnetic metal ions
(Dy3+, Yb3+, Eu3+). To obtain structural information of the glycans, the
pseudocontact shift (PCS) values were determined for each proton and carbon as
the difference of 1H and 13C chemical shift values between the carbohydrate
complex with paramagnetic metal ion and diamagnetic reference in all the three
fragments. The PCS values obtained experimentally were compared with the data
obtained from the computational analysis. The experimental PCS values showed a
good agreement with the back calculated PCS (Q) values. In the case of
Manα1→2Man disaccharide, the better agreement was obtained when europium
(Eu3+) and ytterbium (Yb3+) were used. Europium as paramagnetic ion showed a
narrow distribution around 0.05, ytterbium (Yb) produced the lowest Q-values
on the selected single frames even lower than 0.01 suggesting that both metal
ions are equally good. The characteristic molecular geometries of the
disaccharide Manα1→2Man and Manα1→6Man resulted from the NMR experiments and
molecular dynamics study showed that in case of . disaccharide Manα1→2Man, the
non-reducing mannose Man2 is always in close proximity to the metal ion,
indicating the most probable conformation as shown in the Figure 1a. In case
of Manα1→6Man, the most visited conformation was the extended conformation
showed in Figure 1b. These results confirmed previous observations assigning
the flexibility of the GPI core to the α1→6 linkage, which has an additional
rotation around the glycosidic linkage. Furthermore, this study demonstrated
the high flexibility of the glycans and the need of using a larger and rigid
linker in paramagnetic NMR experiments. The third part of this work focused on
the synthesis of GPI building blocks for the semi-synthesis of GPI-anchored
proteins from protozoan and mammalian cells. For this process, the synthetic
GPIs were obtained containing a cysteine residue attached to the
phosphoethanolamine unit. The cysteine can undergo a chemoselective reaction
with a C terminal protein thioester via a trans-thioesterification and
rearrangement processes to give GPI anchored proteins. The synthesis of the
GPIs 76 and 77 were completed following a convergent synthetic strategy. These
two GPIs are currently being used for the development of semi-synthetic
methods to obtain homogeneous GPI-anchored proteins to reveal the significance
of glypiation in the structure and activity of these proteins.
de
dc.description.abstract
Glykosylphosphatidylinositole (GPIs) bilden die komplexeste Klasse der auf
eukaryotischen Zellmembranen vorkommenden Glykolipide. GPIs haben folgende
gemeinsame Kernstruktur: Manα(1→2)Manα(1→6)Manα(1→4)GlcNα(1→6)-myo-
Inositol-1-PO4-Lipid, die im Allgemeinen auf gewebe- und zellspezifische Art
durch zusätzliche Phosphorylierungen, Kohlenhydratseitenketten und das
Vorkommen weiterer Fettsäureketten modifiziert ist. GPIs können als freie
Glykolipide vorkommen, oder sind mit Hilfe einer Phosphoethanolamin-Einheit am
Man-III-Rest des Glykankerns am C-Terminus von Proteinen verankert. Die so
gebildeten Moleküle werden GPI-verankerte Proteine (GPI-AP) genannt. Diese
GPI-verankerten Proteine spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen
biologischen Prozessen und haben das Interesse vieler synthetischer Chemiker
und Biologen geweckt. In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte unsere
Gruppe zeigen, dass der Kohlenhydratanteil des GPIs von T. gondii als
diagnostischer Marker für Toxoplasmose eingesetzt werden kann, und sogar eine
Unterscheidung zwischen einer latenten und einer akuten Infektion auf der
Basis der Detektion von anti-GPI IgG und IgM Antikörper-Titern in den Seren
von Patienten mittels Mikroarray-Technologie möglich ist. Um das diagnostische
Potential des GPIs von T. gondii für eine sero-epidemiologische Studie zu
erweitern, wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Phosphoglykan-Anteil des
GPIs von T. gondii als Marker synthetisiert und für die Entwicklung eines
diagnostischen Tests für Toxoplasmose in einem Bead-basierten Testverfahren
angewendet. Es wurde gezeigt, dass das ausgewählte GPI-Glykan eingesetzt
werden kann, um zwischen infizierten und gesunden Personen mittels eines
Luminex-basierten sero-diagnostischen Verfahrens zu unterscheiden.
Verschiedene Bedingungen wurden optimiert, darunter Antigen-Konzentration,
Konjugationstyp des sekundären Antikörpers sowie dessen Konzentration,
Verdünnung der Serum-Probe, und die Pufferzusammensetzung. Unter den
optimierten Bedingungen wurden dann 180 humane Serum-Proben analysiert, wobei
die positiven Proben mit 95 % Spezifizität und 76 % Sensitivität identifiziert
werden konnten. Weiterhin wurden diese Ergebnisse mit denen aus einem ELISA-
Test verglichen, was eine Rate von falsch-negativen Ergebnissen von unter 10 %
zeigte. Die hohe Spezifizität zusammen mit wenigen falsch-negativen
Ergebnissen bei Anwendung des GPI-Moleküls zeigen, dass dieses GPI-basierte
Luminex-Verfahren als wertvolles Werkzeug für die Diagnose von Toxoplasmose im
klinischen Umfeld eingesetzt werden kann. Um ein besseres Verständnis der GPI-
Strukturen und der biologischen Funktionen dieser Glykolipide zu erlangen,
wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine paramagnetische NMR-Methode zusammen
mit MD (Molekulardynamik)-Simulationen angewendet, um die Konformation und
Dynamiken des Glykananteils des GPI-Kerns zu untersuchen. Um paramagnetische-
Ionen (Lanthanoide)-unterstützte NMR-Spektroskopie nutzen zu können, wurden
die Disaccharidfragmente Manα1→2Man und Manα1→6Man, sowie das
Trisaccharidfragment Manα1→2Manα1→6Man des GPI-Kerns mit einer chelatbildenden
Verbindung erfolgreich synthetisiert. Zuerst wurde ausgehend von 1,2-diamino-
Benzen ein Linker mit einer Tag-Einheit in vier Schritten synthetisiert.
Daraufhin wurde dieser Linker an das GPI-Fragment, welches ein Amin am
reduzierenden Ende trägt, angehängt. 1H und 1H-13C HSQC Spektren der
synthetisierten getaggten GPI-Fragmente wurden in Gegenwart des
diamagnetischen Referenz-Ions (La3+), sowie in Gegenwart der paramagnetischen
Metallionen (Dy3+, Yb3+, Eu3+) aufgenommen und analysiert. Um strukturelle
Informationen über die Glykane zu erlangen, wurden die PCS-Werte (Pseudo-
Kontakt-Verschiebung) als die Differenz der chemischen Verschiebungen von 1H
und 13C zwischen dem Kohlenhydratkomplex mit paramagnetischem Ion und der
diamagnetischen Referenz in allen drei Fragmenten für jedes Proton und jedes
Kohlenstoffatom berechnet. Die experimentell erhaltenen PCS-Werte wurden
schließlich mit den Daten aus der rechnergestützten Analyse verglichen. Die
experimentellen PCS-Werte zeigen eine gute Übereinstimmung mit den
zurückgerechneten PCS (Q)-Werten. Im Falle des Disaccharid-Fragmentes
Manα1→2Man wurde die höchste Übereinstimmung erreicht, wenn Europium (Eu3+)
und Ytterbium (Yb3+) genutzt wurden. Europium als paramagnetisches Ion zeigte
eine enge Verteilung um 0.05, Ytterbium generierte die niedrigsten Q-Werte für
die ausgewählten Einzelbilder, sogar unter 0.01, was darauf hinweist, dass
beide Metallionen gleichwertig einsetzbar sind. Die charaktieristischen
molekularen Geometrien der Disaccharid-Fragmente Manα1→2Man und Manα1→6Man
ergaben sich aus den NMR-Experimenten und die Molekulardynamik-Modellierung
zeigte, dass im Falle des Disaccharids Manα1→2Man die nichtreduzierende
Mannose Man2 stets in direkter Nachbarschaft zu dem Metallion ist, was die in
Abbildung 1a gezeigte Konformation als die wahrscheinlichste Konformation
nahelegt. Im Falle von Manα1→6Man ist die häufigste Konformation die
gestreckte Konformation, die in Abbildung 1b dargestellt ist. Diese Ergebnisse
bestätigen vorherige Beobachtungen, welche die Flexibilität des GPI-Kerns der
α1→6-Bindung zuordneten, die eine zusätzliche Rotation um die glykosidische
Bindung hat. Außerdem demonstriert diese Studie die hohe Flexibilität der
Glykane und den Bedarf eines größeren und starreren Linkers in
paramagnetischen NMR-Experimenten. Der dritte Teil dieser Arbeit behandelt
schwerpunktmäßig die Synthese von GPI-Bausteinen für die Semi-Synthese von
GPI-verankerten Proteinen von Protozoen sowie Säugerzellen. Dafür wurden die
synthetischen GPIs mit einem Cystein-Rest an der Phosphoethanolamin-Einheit
generiert. Dieser Cystein-Rest kann eine chemoselektive Reaktion mit einem
C-terminalen Protein-Thioester über eine Trans-Thioesterifizierung und
Umlagerungsreaktionen eingehen, um schließlich GPI-verankerte Proteine zu
ergeben. Die Synthese der GPIs 76 und 77 wurde entsprechend einer konvergenten
Synthese-Strategie abgeschlossen. Diese beiden Modell-GPIs werden zurzeit für
die Entwicklung semisynthetischer Methoden für die Herstellung homogener GPI-
verankerter Proteine genutzt, um den Stellenwert der GPI-Verankerung in der
Struktur und Aktivität dieser Proteine deutlich zu machen.
de
dc.format.extent
190 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Glycosylphosphatidylinositol (GPI)
dc.subject
Glycan Synthesis
dc.subject
Conformational Analysis
dc.subject
Paramagnetic NMR
dc.subject
Multiplex Bead Assay
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Conformational Analysis and Application in Diagnostic of
Glycosylphosphatidylinositols Glycan Derivatives
dc.contributor.contact
mgmonika1@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
Dr. Daniel Varon Silva
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rainer Haag
dc.date.accepted
2017-10-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000106801-2
dc.title.translated
Konformationelle Analyse und Diagnostische Anwendung von
Glycosyphosphatidylinositol Glykanderivaten
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000106801
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000023503
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free
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open access