Myocardial hypertrophy is an early milestone during the clinical course of heart failure and an important risk factor for subsequent cardiac morbidity and mortality. Left ventricular wall stress, hormones, cytokines, growth factors and cardiovascular diseases increase cardiac workload and induce myocyte hypertrophy that often leads to overt heart failure. Reduction of left ventricular hypertrophy by anti-hypertensive treatment improves the prognosis of patients. However, only a partial reduction of cardiac hypertrophy is achieved with the available means. Previous studies have focused on the activation of maladaptive signalling pathways in the etiology of cardiac hypertrophy and adverse remodelling. Interestingly, recent results indicate that cardiac hypertrophy is associated with activation of the cell-cycle machinery or with the induction of cell cycle-related proteins and an increase in Cyclin-dependent kinase signalling. Therefore we hypothesized that overexpression of cell cycle inhibitor p21CIP1 repressing Cyclin-dependent kinase signalling could be an effective molecular approach to inhibit cardiac hypertrophy. Due to low gene expression efficiencies by adenovirus or adeno- associated virus vectors in vivo, the TAT protein transduction technique was applied for somatic gene transfer. This method utilizes the ability of an amino-terminal 11 amino-acid protein transduction domain from the human immunodeficiency virus TAT protein to mediate protein transduction. The fusion protein TAT.p21CIP1 was expressed in bacteria and purified under denaturation conditions employing FPLC equipment. Importantly, application of TAT.p21CIP1 fusion protein provided efficient and homogenous gene transfer in vitro and in vivo, allowing assessment of the impact of p21CIP1 on heart remodelling following angiotensin II administration. In contrast to inactive mutant TAT.p21CIP1∆C, TAT.p21CIP1 wild-type protein significantly inhibited features of cardiac hypertrophy such as reexpression of fetal cardiac genes, increased protein synthesis and cardiomyocyte surface area following angiotensin II administration. In summary, we show by means of TAT protein transduction, that p21CIP1 efficiently abrogates angiotensin II-induced hypertrophy in vitro and in vivo.
Die kardiale Hypertrophie stellt einen frühen Meilenstein in der klinischen Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar und ist mit erhöhter Morbidität und Mortalität vergesellschaftet. Dabei führen linksventrikulärer Wandstress, Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren und kardiovaskuläre Erkrankungen zu einer erhöhten kardialen Belastung, die häufig zur Herzinsuffizienz führt. Durch blutdrucksenkende Therapie kann die linksventrikuläre Hypertrophie reduziert und die Prognose des Patienten verbessert werden. Dennoch kann mit der verfügbaren pharmakologischen Therapie in der Regel maximal eine partielle Reduktion der Hypertrophie erreicht werden. Die Kenntnis molekularer Mechanismen der linksventrikulären Hypertrophie erlaubt die Entwicklung neuer molekularer Therapieansätze. Vorausgegangene Studien haben sich meist mit der Aktivierung maladaptiver Signalwege in der Entstehung der linksventrikulären Hypertrophie und des myokardialen Remodelling beschäftigt. Interessanterweise weisen neuere Studien auf eine Induktion Zellzyklus relevanter Gene und erhöhte Zyklin-abhängige Kinaseaktivitäten in der Hypertrophieentstehung hin. Daraufhin entwickelten wir die Hypothese, dass eine Hemmung Zyklin-abhängiger Kinaseaktivitäten durch den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p21CIP1 ein bedeutsamer molekularer Ansatz in der Behandlung der myokardialen Hypertrophie sein könnte. Aufgrund nur geringer Effizienzen der Expression eines Transgens nach adeno- oder adeno-assoziiert-viralem somatischem Gentransfer in vivo, verwendeten wir die TAT Protein-Transduktionstechnik. Hierbei wurde der Inhibitor Zyklin-abhängiger Kinasen, p21CIP1, als Fusionsprotein kloniert, das an seinem aminoterminalen Ende die 11 Aminosäuren umfassende Protein- Transduktionsdomäne des humanen HIV TAT-Proteins enthält (TAT.p21 CIP1). TAT.p21 CIP1 wurde in Bakterien exprimiert und unter denaturierenden Bedingungen mit Hilfe eines FPLC-Verfahrens bis zur Homogenität aufgereinigt. Proteintransduktion von TAT.p21CIP1 führte zu einem homogenen Proteintransfer sowohl in Zellkulturexperimenten neonataler Rattenkardiomyozyten als auch nach intraperitonealer Injektion adulter Mäuse. Dabei inhibierte TAT.p21CIP1 in einer Dosis-abhängigen Weise Angiotensin II induziertes hypertrophes Wachstum in vitro und in vivo. Dies wurde bestimmt durch Northernblott-Analysen zur Expression der molekularen Hypertrophiemarker ANF und β-MHC, der Kinaseaktivität von Cdk2 sowie Bestimmung der Proteinsynthese und Kardiomyozytengröße. Keinen Einfluss auf die Entwicklung der Hypertrophie hatte ein mutiertes TAT.p21CIP1∆C, in dem der Carboxylterminus deletiert wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass TAT.p21CIP1 Proteintransduktion zu einer Inhibition Angiotensin II induzierter Hypertrophie in vitro und in vivo führt.
