In nature, protein function is coordinated by complex protonation dynamics. Observing protons directly during protein reactions is central to understanding of basic physiology, yet few techniques provide such molecular detail. Infrared spectroscopy enables the identification of functional groups involved in protonation events and can be coupled with various accessories to facilitate chemical reactions. This technique provides insights into the chemistry of amino acid side chains and protein cofactors with high specificity. This study applies infrared spectroscopy to Complex IV of the mitochondrial respiratory chain, cytochrome c oxidase (CcO). This membrane protein contributes to the proton motive force required for ATP synthesis by reducing molecular oxygen to water and helps limit mitochondrial reactive oxygen species. Given its function as a proton pump, infrared spectroscopy is ideal for investigating CcO’s reaction mechanism, offering insights into mitochondrial physiology and potential therapeutic applications. The catalytic cycle of CcO is often analyzed through artificial transitions between states that resemble physiological intermediates. These transitions typically involve altering the redox states of CcO’s heme cofactors, which causally control enzymatic catalysis and are tightly linked to structural changes and proton pumping via proton-coupled electron transfer. Physiologically relevant information can be inferred from the non-natural transitions using reaction-induced infrared spectroscopy. This work explores the interconversion between different reduced states of CcO during the reductive phase of the catalytic cycle, as well as their interconversion into relevant states in the oxidative phase. These reactions are observed using multiple techniques, each offering control over distinct reaction coordinates. Carbon monoxide serves as an environmental probe due to its sensitivity to the vibrational Stark effect. Specifically, spectroelectrochemistry resolves heme-specific redox effects by scanning different potentials, in situ infrared spectroscopy monitors complete enzyme oxidation by molecular oxygen, and time-resolved infrared spectroscopy tracks electron flow upon photolysis of ligated states, mimicking early catalytic intermediates. The resulting reaction-induced difference spectra reveal minute molecular changes of CcO on the level of single bonds. A major finding is that the protonation state of E286, a glutamic acid residue implicated in preventing proton backflow, is controlled solely by the redox state of heme a. This residue also undergoes H-bonding rearrangements between the oxidized and two-electron reduced states, likely toggling between a proton uptake pathway and a shared water cluster near the P-side of the protein. These results clarify E286’s role in proton-coupled electron transfer immediately after enzymatic reduction. Additionally, the role of heme a3 propionate groups as a potential proton-loading site is analyzed in light of experimental observations. The use of nanodiscs as a biomimetic system was investigated, demonstrating that protein activation results in specific spectral features that could serve as useful reporters for membrane-protein interactions beyond CcO. These signals were monitored in a time-resolved fashion and by direct oxidation with molecular oxygen. Results show that different phospholipid compositions do not hinder enzymatic activity, and the presence of ligands also has negligible effects when the enzyme undergoes multiple catalytic cycles.
Die Funktion von Proteinen wird in der Natur durch komplexe Protonierungsdynamiken reguliert. Die direkte Beobachtung von Protonen während Proteinreaktionen ist entscheidend für das Verständnis physiologischer Prozesse, doch nur wenige Methoden bieten eine ausreichende molekulare Auflösung. Die Infrarotspektroskopie ermöglicht die Identifizierung funktioneller Gruppen, die an Protonierungsereignissen beteiligt sind. In Kombination mit unterschiedlichen experimentellen Ansätzen können chemische Reaktionen gezielt ausgelöst werden, was hochspezifische Einblicke in die Chemie von Aminosäureseitenketten und Kofaktoren liefert. In dieser Arbeit wird Komplex IV der mitochondrialen Atmungskette, die sogenannte Cytochrom-c-Oxidase (CcO), mittels Infrarotspektroskopie untersucht. Als Membranprotein reduziert CcO molekularen Sauerstoff zu Wasser und trägt zur Bildung der protonenmotorischen Kraft bei, die für die ATP-Synthese erforderlich ist. Aufgrund der Funktion des Proteins als Protonenpumpe eignet sich Infrarotspektroskopie besonders zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus der CcO mit Relevanz für die mitochondriale Physiologie und potenzielle therapeutische Anwendungen. Der katalytische Zyklus wird häufig über künstliche Übergänge zwischen Redoxzuständen analysiert, die physiologischen Intermediaten ähneln. Diese Zustände steuern die enzymatische Aktivität durch Veränderungen an den Häm-Kofaktoren a und a3, die die katalytische Reaktion kontrollieren und eng mit Strukturänderungen und Protonentransport durch protonengekoppeltem Elektronentransfer verbunden sind. Reaktionsinduzierte Infrarotspektroskopie erlaubt die Untersuchung dieser molekularen Prozesse mit hoher Auflösung. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Umwandlung verschiedener reduzierter Zustände während der reduktiven Phase des Zyklus sowie ihr Übergang in katalytisch relevante oxidative Zustände. Mehrere spektroskopische Techniken ermöglichen die gezielte Steuerung einzelner Reaktionsbedingungen, wobei Kohlenmonoxid über den Schwingungs-Stark-Effekt als empfindliche Umgebungs-Sonde fungieren kann. Spektroelektrochemie differenziert zwischen redoxspezifischen Effekten einzelner Häm-Kofaktoren, in-situ Infrarotspektroskopie verfolgt die Enzymoxidation durch molekularen Sauerstoff, und die zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie erfasst Elektronenflüsse nach der Photolyse CO-gebundener Zustände. Die resultierenden Differenzspektren zeigen kleinste molekulare Veränderungen mit der Auflösung einzelner Bindungen. Ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit ist, dass der Protonierungszustand von E286, einer für den gerichteten Protonentransport zentralen Glutaminsäure, ausschließlich durch den Redoxzustand von Häm a kontrolliert wird. Zwischen oxidiertem und zweifach reduziertem Zustand treten zudem Umorganisierungen von Wasserstoffbrücken auf, die auf eine funktionelle Umschaltung zwischen einem Protonenaufnahmeweg und einem Wassernetzwerk auf der P-Seite des Proteins hinweisen. Auch die Rolle der Propionatgruppen von Häm a3 als mögliche Protonenspeicherstelle wird im Kontext experimenteller Befunde diskutiert. Abschließend wurde der Einsatz von Nanodiscs als biomimetisches Membransystem untersucht. Die Aktivierung des Proteins führt zu spezifischen spektralen Merkmalen, die als molekulare Reporter für Membran-Protein-Wechselwirkungen geeignet sein könnten. Diese Signale wurden sowohl zeitaufgelöst als auch durch direkte Oxidation mit molekularem Sauerstoff verfolgt. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Lipidzusammensetzungen die enzymatische Aktivität nicht beeinträchtigen und die Ligandenbindung vernachlässigbare Effekte über mehrere katalytische Zyklen hinweg verursacht.
