TraG/VirD4-like proteins are essential components of bacterial type IV secretion systems. During secretion, they are thought to translocate defined substrates through the inner cell membrane. The energy for this transport is presumably delivered by hydrolysis of nucleotides, since sequence-analysis identified TraG/VirD4-like proteins as potential nucleotide hydrolases (NTPases). In the present work, four representatives of the family of TraG/VirD4-like proteins were biochemically characterized and partly genetically analyzed: TraG (RP4), TrwB (R388), TraD (F) and HP0524 (H. pylori). These proteins were found to have a pronounced tendency to form oligomers and to bind DNA without sequence specificity. The purified proteins did not possess the proposed NTP hydrolyzing activity in vitro. TraG was however shown to bind ATP, as it had previously been detected for TrwB. Apart from binding ATP, TraG and TrwB were also found to bind ADP. Other nucleotides (GTP, CTP, UTP, dTTP) were effective competitors for ATP-binding. The DNA- and nucleotide-binding activities were both inhibited by Mg2+ and were found to functionally overlap. Using surface plasmon resonance (SPR) technology, the interaction of TraG with the essential secretion component TraI was demonstrated, providing the first direct evidence for this type of interaction. Topology analysis of TraG revealed that TraG contains a membrane anchor close to the N-terminus. Functionally essential domains of TraG were identified by insertion mutagenesis. The identified sequence domains were mapped to the corresponding structural determinants by comparison to the known crystal structure of TrwB, providing a detailed overview on the relation between sequence, structure, and function of TraG-like proteins. Deletion- and point mutation derivatives of TraG and TrwB were purified and characterized. The cytoplasmic domain was found to be functional in both DNA- and ATP- binding. However, removal of the membrane anchor prevented oligomerization of TraG and TrwB. Furthermore, the affinity of TraG for TraI was lost, probably as a direct consequence of the failure of the truncated protein to oligomerize. Point mutation at conserved Walker A sequence motif (P-loop motif) of TraG caused a significant decrease of its nucleotide-binding activity but did not affect the affinity for DNA or TraI. In this study, the multiple activities of TraG and TrwB were thus dissected structurally and functionally. Comparative analysis of several representatives of the family of TraG/VirD4-like proteins contributed substantially in understanding the function of this key component of type IV secretion.
TraG/VirD4-ähnliche Proteine sind essentielle Komponenten bakterieller Typ IV Sekretionssysteme. Ihre Funktion besteht wahrscheinlich im Transport definierter Substrate durch die innere Membran. Die für dafür benötigte Energie wird möglicherweise durch Nukleotid-Hydrolyse gewonnen, denn TraG/VirD4-ähnliche Proteine wurden aufgrund von Sequenzmotiven als potentielle Nukleotid-Hydrolasen (NTPasen) identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Vertreter der Familie der TraG/VirD4-ähnlichen Proteine biochemisch charakterisiert und zum Teil genetisch analysiert: TraG (RP4), TrwB (R388), TraD (F) und HP0524 (H. pylori). Diese Proteine besaßen eine sequenz-unspezifische DNA-Bindungsaffinität und hatten eine ausgeprägte Tendenz zur Oligomerisierung. Entgegen der Vorhersage konnte keine NTPase Aktivität in vitro nachgewiesen werden. Es wurde jedoch gezeigt, daß ATP durch TraG gebunden wurde, so wie es schon für TrwB beschrieben worden ist. Zusätzlich zur ATP-Bindung konnte eine ADP-Bindung nachgewiesen werden. Andere Nukleotide (GTP, CTP, UTP, dTTP) wurden als Kompetitoren zu ATP ebenfalls gebunden. DNA- und Nukleotid-Bindung waren miteinander konkurrierende Aktivitäten, die beide durch Mg2+ inhibiert wurden. Mittels Oberflächen- Plasmonresonanz (SPR) -Technologie wurde gezeigt, daß TraG mit dem für die Sekretion essentiellen Protein TraI interagiert. Dies war der erste direkte Beweis für solch eine Interaktion. Eine Topologieanalyse von TraG ergab, daß TraG einen Membrananker nahe dem N-Terminus besitzt. Durch Insertions- Mutagenese wurden funktional essentielle Domänen von TraG identifiziert. Nach Sequenzvergleich mit TrwB, dessen Kristallstruktur bekannt ist, konnten die so identifizierten Domänen den strukturellen Determinanten des Proteins zugeordnet werden. Deletions- und Punktmutanten von TraG und TrwB wurden gereinigt und charakterisiert. Dadurch wurde gezeigt, daß die cytoplasmatische Domäne auch ohne Membrananker sowohl an DNA, als auch an Nukleotide bindet. Hingegen gingen die Fähigkeit zur Oligomerisierung und zur Interaktion mit TraI verloren. Letzteres ließ vermuten, daß die Oligomerisierung Voraussetzung für die Bindung an TraI ist. Punktmutation im konservierten Walker A Sequenzmotif (P-loop) von TraG hatte eine signifikante Abschwächung der Nukleotidbindung zur Folge, die TraI- und DNA-Bindungsaffinitäten blieben hingegen unverändert. In dieser Arbeit konnten die verschiedenen Aktivitäten von TraG und TrwB strukturell und funktionell voneinander getrennt werden. Die vergleichende Analyse verschiedener Vertreter der VirD4/TraG-ähnlichen Proteine leistete einen entscheidenden Beitrag zur Aufklärung der Funktion dieser Schlüsselkomponente der Typ IV Sekretion.
