The optical resolution by human eyes is limited. This is why microscopes were invented, to enable the observation of smaller objects through a specific arrangement of optical components, as well as the investigation of biological processes regarding disease or treatment. Through the microscope’s eye, the camera, images of various tissue stainings can be digitalized and stored on computers. At this time, image interpretation is often performed by the investigator. Manual annotation or counting is a subjective process by the observer, time consuming and therefore perhaps biased. Additional physical limitations increase the chance of misinterpretation regarding aberrations or other distortion artifacts, as well as complexity, which increases by the growing number of available parameters from the same location, notably in spatial gene expression detection. Bioimage analysis, as a newly emerging field in recent years, combines data analysis and imaging methods related to the study of biological processes and has led me to this work, where image data from various microscopy techniques were used to create supervised- and unsupervised bioimage analysis workflows validating biological questions in tissue samples from mouse and human, which were conceptually developed on the MELC system. Thereby, the MELC-system was improved to its overall image quality regarding resolution (laterally 60%, axial 250%), duration of MELCexperiments (reduction of heat and related drying of tissue sample, increase of detectable fluorescence signals) and signal evaluation (artifact removal). The application of system related artifact removal algorithms, such as image registration, illumination correction, image projections or destriping were part of required image pre-processing, which standardized subsequent image segmentation in ilastik and CellProfiler. Classification of found objects or cells benefited from clustering or dimensionality reduction methods simplifying complexity of multi parameter data sets. The application of neighborhood analysis supported the investigation with regard to spatial localizations and interaction. Based on quantitative image analysis workflows developed, including image pre-processing, image segmentation, object identification, classification and representation of the results, a general path from image acquisition to meaningful data evaluation as tool for users could was realized in case of LSM, MELC and LSFM data. Furthermore, the application of MELC and ST linked the information obtained between the protein and transcriptional level. In this way several observations were made, which helped to answer questions in immunology and neuroscience. Segmented LSM images of microglia from aging mice revealed the morphological changes and loss of processes during the course of dementia, using DFT descriptors as a compact way to describe complex shapes. The distribution of the complex compartment of stromal markers in the bone marrow of mice was heterogeneous, which can provide insights into their roles in hematopoiesis and immune cell development. Supervised and unsupervised image analysis workflows identified rare ILC populations in MELC images of mouse tonsils. In addition, their location around vessels and fibronectin fibers was detected by neighborhood analysis. Finally, SARS-CoV-2-induced tissue remodeling was observed in human lung samples from MELC and ST experiments.
Die optische Auflösung des menschlichen Auges ist begrenzt. Deshalb wurden Mikroskope erfunden, um die Beobachtung kleinerer Objekte durch eine bestimmte Anordnung optischer Komponenten sowie die Untersuchung biologischer Prozesse im Hinblick auf Krankheit oder Behandlung zu ermöglichen. Mit Hilfe des Auges des Mikroskops, der Kamera, können Bilder von verschiedenen Gewebefärbungen digitalisiert und auf Computern gespeichert werden. Zu diesem Zeitpunkt wird die Bildinterpretation häufig vom Untersucher selbst vorgenommen. Die manuelle Markierung oder Zählung ist ein subjektiver Prozess des Beobachters, zeitaufwändig und daher möglicherweise voreingenommen. Zusätzliche physikalische Begrenzungen erhöhen das Risiko von Fehlinterpretationen in Bezug auf Aberrationen oder andere Verzerrungsartefakte sowie die Komplexität, die durch die wachsende Anzahl verfügbarer Parameter am selben Ort zunimmt, insbesondere bei der Erkennung der räumlichen Genexpression. Die Biobild-Analyse, ein in den letzten Jahren neu aufkommender Bereich, kombiniert Datenanalyse und bildgebende Verfahren zur Untersuchung biologischer Prozesse und hat mich zu dieser Arbeit geführt, bei der Bilddaten aus verschiedenen Mikroskopietechniken verwendet wurden, um überwachte und unüberwachte Biobild-Analyse-Arbeitsabläufe zur Validierung biologischer Fragen in Gewebeproben von Maus und Mensch zu erstellen, die konzeptionell auf dem MELC-System entwickelt wurden. Dabei wurde das MELC-System hinsichtlich seiner Gesamtbildqualität in Bezug auf Auflösung (lateral 60%, axial 250%), Dauer der MELC-Experimente (Reduktion der Hitze und damit verbundener Trocknung der Gewebeprobe, Erhöhung der detektierbaren Fluoreszenzsignale) und Signalauswertung (Artefaktentfernung) verbessert. Die Anwendung systembezogener Algorithmen zur Beseitigung von Artefakten, wie Bildregistrierung, Beleuchtungskorrektur, Bildprojektionen oder Entstreifung waren Teil der erforderlichen Bildvorverarbeitung, die die anschließende Bildsegmentierung in ilastik und CellProfiler standardisierte. Die Klassifikation der gefundenen Objekte oder Zellen profitierte von Clustering- oder Dimensionalitätsreduktionsverfahren, die die Komplexität der mehrparametrigen Datensätze vereinfachten. Die Anwendung von Nachbarschaftsanalysen unterstützte die Untersuchung im Hinblick auf räumliche Lokalisierungen und Interaktionen. Basierend auf den entwickelten quantitativen Bildanalyse-Workflows, die Bildvorverarbeitung, Bildsegmentierung, Objektidentifikation, Klassifikation und Ergebnisdarstellung umfassen, konnte im Falle von LSM-, MELC- und LSFM-Daten ein allgemeiner Weg von der Bildaufnahme bis zur aussagekräftigen Datenauswertung als Werkzeug für die Nutzer realisiert werden. Darüber hinaus wurden durch die Anwendung von MELC und ST die gewonnenen Informationen zwischen der Protein- und der Transkriptionsebene verknüpft. Auf diese Weise konnten mehrere Beobachtungen gemacht werden, die zur Beantwortung von Fragen in der Immunologie und den Neurowissenschaften beitragen. Segmentierte LSM-Bilder von Mikroglia aus alternden Mäusen zeigten die morphologischen Veränderungen und den Verlust von Prozessen im Verlauf der Demenz, wobei DFT-Deskriptoren als kompakte Methode zur Beschreibung komplexer Formen verwendet wurden. Die Verteilung des komplexen Kompartiments stromaler Marker im Knochenmark von Mäusen war heterogen, was Einblicke in ihre Rolle bei der Hämatopoese und der Entwicklung von Immunzellen geben kann. Durch überwachte und nicht überwachte Bildanalyse-Arbeitsabläufe wurden seltene ILC-Populationen in MELC-Bildern von Mäusemandeln identifiziert. Darüber hinaus wurde ihre Lage in der Nähe von Gefäßen und Fibronektinfasern durch Nachbarschaftsanalyse ermittelt. Schließlich wurde in menschlichen Lungenproben aus MELC- und ST-Experimenten ein SARS-CoV-2-induzierter Gewebeumbau beobachtet.
