Spleißen ist neben 5‘-Capping und 3‘-Polyadenylierung ein wichtiger Punkt im Lauf der Prozessierung eukaryotischer prä-mRNA. Nichtkodierende Introns werden von der prä-mRNA entfernt und kodierende Exons fusioniert. Doch eine prä-mRNA kann in weitaus mehr als einem Protein resultieren, was durch alternatives Spleißen ermöglicht wird. Über 90 % aller humanen Proteinkodierenden Gene unterstehen diesem Prozess, der zelltyp- bzw. gewebs- und differenzierungsspezifisch ist. Signal-induziertes alternatives Spleißen ist eine Möglichkeit, die Genexpression in Anpassung an Änderungen im physiologischen Umfeld zu regulieren. Der Prozess der T-Zell Aktivierung ist diesbezüglich ein Modelsystem, in dem weit über 100 Exons als alternativ gespleißt identifiziert werden konnten. Wie diese Änderungen im Spleiß- Verhalten zur Funktionalität aktivierter T-Zellen beitragen, konnte jedoch noch nicht hinreichend gezeigt werden. Die T-Zell Aktivierung ist ein komplexer und dynamischer Prozess, der in der aktivierten Zelle u.a. zu einer stark erhöhten Produktion und Sekretion von Effektormolekülen wie Zytokinen und Zytotoxinen führt. Hierfür wird angenommen, dass sich der Sekretionsapparat an die höhere Transportlast anpasst. Wie dies geschieht, ist indes nicht bekannt. Proteinsekretion beginnt an ribosomfreien Stellen des ER, den ER exit sites (ERES), wo neu synthetisierte Proteine in COPII-Vesikel für ihren Transport verpackt werden. Sec16 ist ein peripheres Membranprotein an den ERES und maßgeblich in den Prozess der Vesikelbildung und –abschnürung involviert. Ein in Metazoen konservierter Bereich von ca. 220 Aminosäuren im C-Terminus des Proteins, die C-Terminale konservierte Domäne (CTD) wird u.a. von zwei Exons kodiert (E29 und E30), die nach T-Zell-Aktivierung alternativ gespleißt werden. Diese Arbeit kombiniert biochemische und zellbiologische Methoden, um die funktionelle Relevanz Sec16 Spleißens in der T-Zell Aktivierung zu untersuchen. Initiale Experimente zeigen, dass aktivierte T-Zellen eine erhöhte Sekretionseffizienz aufweisen, die möglicherweise durch eine erhöhte Anzahl an COPII-Vesikeln ermöglicht wird. Durch Manipulation des Spleißverhaltens in einer humanen T-Zell Linie und Etablierung Sec16E29 defizienter Hek293 Zellen mittels Crispr/Cas9 wird gezeigt, dass alternatives Sec16 Spleißen für die Zunahme an COPII-Vesikeln und der Transporteffizienz notwendig ist. Dies wird durch Versuche mit primären humanen PBMCs unterstrichen. Coimmunopräzipitationen belegen eine differenzielle Interaktion der alternativen Sec16 CTDs mit anderen COPII-Proteinen. Zusätzlich zeigen FRAP-Experimente, dass sich der COPII Turnover in Abhängigkeit von Sec16 Spleißen verändert. Diese Arbeit beschreibt die Funktionalität eines Signal- induzierten Spleißvorgangs und schlägt eine neue Form der Regulation im COPII- vermittelten sekretorischen Apparat vor.
Beside 5‘-capping and 3‘-polyadenylation, splicing is one major step during eukaryotic pre-mRNA processing. Noncoding introns are removed from the pre- mRNA and coding exons are fused. Due to alternative splicing one single pre- mRNA can result in far more than one protein. Over 90 % of the human protein coding genes undergo this process which acts in a cell type, tissue and differentiation dependent manner. Signal-induced alternative splicing is one possible mechanism to control gene expression due to changes in cellular conditions. In response to T-cell activation hundreds of exons were shown to be alternatively spliced, however, how these splicing switches impact on cellular functionality is largely unknown. T-cell activation is a complex and dynamic process leading, amongst others, to dramatic changes in the production and secretion of effector molecules. Therefore, an increase of the protein secretion capacity seems required. However, how this is achieved remains unknown. Protein secretion starts at special sites of the ER, so called ER exit sites (ERES), where newly synthesized proteins are packed in COPII-coated vesicles for further transport. Sec16 is a peripheral membrane protein at these ERES and necessary for vesicle formation and budding. A part of approximately 220 amino acids in the C-terminal part of the protein, the C-terminal conserved domain (CTD), which is conserved in metazoans, is amongst others encoded by two exons (E29 and E30) that are alternatively spliced upon T-cell activation. This work combines biochemical and cell biological methods to analyse the functional relevance of Sec16 alternative splicing upon T-cell activation. Initial experiments show that activated T-cells have a higher secretion efficiency that might be facilitated by a higher number of COPII coated vesicles. Manipulation of the splicing pattern in a human T-cell line and generation of Sec16E29 deficient Hek293 cells using Crispr/Cas9 show that splicing of Sec16 is required for the increase of COPII coated vesicles and the higher export efficiency. This is underlined by experiments using primary human PBMCs. Coimmunoprecipitations prove a differential interaction of the alternative Sec16-CTDs with other COPII proteins. Additionally FRAP experiments show that COPII Turnover is altered due to Sec16 alternative splicing. This work describes the functional impact of a signal induced splicing switch and provides a new regulatory mechanism for COPII mediated protein secretion.
