dc.contributor.author
Wilhelmi, Ilka
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:46:31Z
dc.date.available
2016-03-30T13:15:20.615Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4245
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8445
dc.description.abstract
Spleißen ist neben 5‘-Capping und 3‘-Polyadenylierung ein wichtiger Punkt im
Lauf der Prozessierung eukaryotischer prä-mRNA. Nichtkodierende Introns werden
von der prä-mRNA entfernt und kodierende Exons fusioniert. Doch eine prä-mRNA
kann in weitaus mehr als einem Protein resultieren, was durch alternatives
Spleißen ermöglicht wird. Über 90 % aller humanen Proteinkodierenden Gene
unterstehen diesem Prozess, der zelltyp- bzw. gewebs- und
differenzierungsspezifisch ist. Signal-induziertes alternatives Spleißen ist
eine Möglichkeit, die Genexpression in Anpassung an Änderungen im
physiologischen Umfeld zu regulieren. Der Prozess der T-Zell Aktivierung ist
diesbezüglich ein Modelsystem, in dem weit über 100 Exons als alternativ
gespleißt identifiziert werden konnten. Wie diese Änderungen im Spleiß-
Verhalten zur Funktionalität aktivierter T-Zellen beitragen, konnte jedoch
noch nicht hinreichend gezeigt werden. Die T-Zell Aktivierung ist ein
komplexer und dynamischer Prozess, der in der aktivierten Zelle u.a. zu einer
stark erhöhten Produktion und Sekretion von Effektormolekülen wie Zytokinen
und Zytotoxinen führt. Hierfür wird angenommen, dass sich der
Sekretionsapparat an die höhere Transportlast anpasst. Wie dies geschieht, ist
indes nicht bekannt. Proteinsekretion beginnt an ribosomfreien Stellen des ER,
den ER exit sites (ERES), wo neu synthetisierte Proteine in COPII-Vesikel für
ihren Transport verpackt werden. Sec16 ist ein peripheres Membranprotein an
den ERES und maßgeblich in den Prozess der Vesikelbildung und –abschnürung
involviert. Ein in Metazoen konservierter Bereich von ca. 220 Aminosäuren im
C-Terminus des Proteins, die C-Terminale konservierte Domäne (CTD) wird u.a.
von zwei Exons kodiert (E29 und E30), die nach T-Zell-Aktivierung alternativ
gespleißt werden. Diese Arbeit kombiniert biochemische und zellbiologische
Methoden, um die funktionelle Relevanz Sec16 Spleißens in der T-Zell
Aktivierung zu untersuchen. Initiale Experimente zeigen, dass aktivierte
T-Zellen eine erhöhte Sekretionseffizienz aufweisen, die möglicherweise durch
eine erhöhte Anzahl an COPII-Vesikeln ermöglicht wird. Durch Manipulation des
Spleißverhaltens in einer humanen T-Zell Linie und Etablierung Sec16E29
defizienter Hek293 Zellen mittels Crispr/Cas9 wird gezeigt, dass alternatives
Sec16 Spleißen für die Zunahme an COPII-Vesikeln und der Transporteffizienz
notwendig ist. Dies wird durch Versuche mit primären humanen PBMCs
unterstrichen. Coimmunopräzipitationen belegen eine differenzielle Interaktion
der alternativen Sec16 CTDs mit anderen COPII-Proteinen. Zusätzlich zeigen
FRAP-Experimente, dass sich der COPII Turnover in Abhängigkeit von Sec16
Spleißen verändert. Diese Arbeit beschreibt die Funktionalität eines Signal-
induzierten Spleißvorgangs und schlägt eine neue Form der Regulation im COPII-
vermittelten sekretorischen Apparat vor.
de
dc.description.abstract
Beside 5‘-capping and 3‘-polyadenylation, splicing is one major step during
eukaryotic pre-mRNA processing. Noncoding introns are removed from the pre-
mRNA and coding exons are fused. Due to alternative splicing one single pre-
mRNA can result in far more than one protein. Over 90 % of the human protein
coding genes undergo this process which acts in a cell type, tissue and
differentiation dependent manner. Signal-induced alternative splicing is one
possible mechanism to control gene expression due to changes in cellular
conditions. In response to T-cell activation hundreds of exons were shown to
be alternatively spliced, however, how these splicing switches impact on
cellular functionality is largely unknown. T-cell activation is a complex and
dynamic process leading, amongst others, to dramatic changes in the production
and secretion of effector molecules. Therefore, an increase of the protein
secretion capacity seems required. However, how this is achieved remains
unknown. Protein secretion starts at special sites of the ER, so called ER
exit sites (ERES), where newly synthesized proteins are packed in COPII-coated
vesicles for further transport. Sec16 is a peripheral membrane protein at
these ERES and necessary for vesicle formation and budding. A part of
approximately 220 amino acids in the C-terminal part of the protein, the
C-terminal conserved domain (CTD), which is conserved in metazoans, is amongst
others encoded by two exons (E29 and E30) that are alternatively spliced upon
T-cell activation. This work combines biochemical and cell biological methods
to analyse the functional relevance of Sec16 alternative splicing upon T-cell
activation. Initial experiments show that activated T-cells have a higher
secretion efficiency that might be facilitated by a higher number of COPII
coated vesicles. Manipulation of the splicing pattern in a human T-cell line
and generation of Sec16E29 deficient Hek293 cells using Crispr/Cas9 show that
splicing of Sec16 is required for the increase of COPII coated vesicles and
the higher export efficiency. This is underlined by experiments using primary
human PBMCs. Coimmunoprecipitations prove a differential interaction of the
alternative Sec16-CTDs with other COPII proteins. Additionally FRAP
experiments show that COPII Turnover is altered due to Sec16 alternative
splicing. This work describes the functional impact of a signal induced
splicing switch and provides a new regulatory mechanism for COPII mediated
protein secretion.
en
dc.format.extent
107 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
alternative splicing
dc.subject
T-cell activation
dc.subject
secretory pathway
dc.subject
COPII vesicles
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Die Bedeutung von Sec16 alternativem Spleißen für den COPII vermittelten
Proteintransport in T-Zellen.
dc.contributor.contact
ilka.wilhelmi@fu-berlin.de
dc.contributor.inspector
Volker Haucke
dc.contributor.inspector
Sutapa Chakrabarti
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Florian Heyd
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Markus Wahl
dc.date.accepted
2016-02-26
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000101620-6
dc.title.translated
The role of Sec16 alternative splicing for COPII mediated protein transport in
T-cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000101620
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018877
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access